[發明專利]熱休克蛋白基因啟動子在調控siRNA表達中的應用及其表達系統和重組表達載體

有效

• 申請號: 201210561225.5
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN102994548A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 唐麗靈;廖意;馮建國;易茜;崔瀚威;何玲
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

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技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及熱休克蛋白基因啟動子在調控siRNA表達中的應用，還涉及含有熱休克蛋白基因啟動子的表達系統和重組表達載體。

背景技術

RNA干涉（RNAinterference，RNAi）是近年來發現的在生物體內普遍存在的一種古老的生物學現象，是由dsRNA介導的、特定酶參與的特異性基因沉默現象，它在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達，該機制是真核生物體抵抗外源基因（如病毒基因、轉座子、人工轉入基因等）入侵的一種保護性反應，也是生物體在不同時期通過調控基因表達來調節細胞分化的機制。1999年，Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次發現，21-25nt的dsRNA的出現對轉基因導致基因沉默十分重要，同時指出RNAi作用是由部分純化的核酸酶中所含的siRNA介導的。Zamore?等用dsRNA轉染未經dsRNA處理過的果蠅胚胎細胞的提取物，結果發現：只有在特異性dsRNA存在的條件下mRNA才被降解，而且斷裂的位置僅限于dsRNA的相應序列，進一步證明mRNA的斷裂是以siRNA為模板。Small?interfering?RNA（siRNA）是一種小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase?ó家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成。siRNA是siRISC的主要成員，具有介導與之互補的目標mRNA降解的作用。siRNA的產生主要通過兩種手段，一是直接合成RNA片段，另一種是通過載體復制得到的，也是現階段應用最廣的方法。但以往構建的大多數siRNA載體不能在沉寂目的基因的表達量上進行調控，因此在應用siRNA技術研究一些特定基因如與細胞生長、發生、發展密切相關的基因時，由于不能精細調控抑制目的基因的表達程度可能同時會影響正常細胞的生長與增殖。因此可調控、可誘導系統被認為是未來RNAi的重要發展方向。誘導型siRNA可以通過誘導物來調節RNAi系統，從而實現目的基因的定量誘導表達抑制。目前應用的誘導體系有cre2loxP系統，四環素誘導體系，蛻皮素誘導體系和乳糖誘導體系。應用最多的誘導劑有四環素、蛻皮素類。目前誘導型RNAi?技術已應用到腫瘤基因治療的相關研究中，如結腸癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等癌癥的細胞體外研究和實驗動物的體內研究已經卓有成效，為腫瘤的基因治療提供了新的思路。但是當前的可調控系統主要存在以下2種缺陷：（1）免疫反應：調控元件一般會生成蛋白類反應因子，在體內觸發宿主???????????????????????????????????????????????型主要組織相容性抗原復合物（MHC-）介導的免疫反應，Ginhoux等在rtTA上發現CD8+特異性抗原簇，激活細胞毒性T淋巴細胞（CTL）導致rtTA表達陽性靶細胞的裂解；（2）漏表達（leaky?expression）即在調控抑制狀態下存在不同程度目的基因的表達，形成背景噪音。由于哺乳動物的基因系統是復雜的多級、多途徑環路，基礎表達不可避免。

發明內容

本發明的目的之一在于提供熱休克蛋白基因啟動子在調控siRNA表達中的應用，不表達多余的蛋白類反應因子，避免了調控蛋白在機體中發生免疫反應，同時調控精確，不存在漏表達。

為實現上述發明目的，技術方案為：

熱休克蛋白基因啟動子在調控siRNA表達中的應用。

優選的，所述熱休克蛋白基因啟動子如SEQ?ID?NO.3中第9-347位所示的核苷酸序列。

優選的，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。

本發明的目的之二在于提供含有熱休克蛋白基因啟動子的siRNA表達系統，能夠用于表達siRNA，技術方案為：

含有所述熱休克蛋白基因啟動子的siRNA表達系統。

優選的，所述熱休克蛋白基因啟動子如SEQ?ID?NO.3中第9-347位所示的核苷酸序列。

優選的，所述熱休克蛋白基因啟動子的3’端還含有內含子剪切位點保守序列。

更優選的，所述內含子剪切位點保守序列的核苷酸序列為actagtac（Nn）ctgctagc；

其中N表示任意堿基，n表示任意數字。

更優選的，所述內含子剪切位點保守序列的核苷酸序列為actagtacctcgagcggggggtaccctgctagc。

本發明的目的之三在于提供含有所述熱休克蛋白基因啟動子重組載體，受熱調控靈敏，43℃條件下能夠誘導熱休克蛋白基因啟動子下游基因表達，技術方案為：

含有所述熱休克蛋白基因啟動子重組表達載體。