[發明專利]一種酸敏感雙光發射探針、制備方法及其用途

有效

• 申請號: 201210561174.6
• 申請日: 2012-12-21
• 公開（公告）號: CN103214494A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 朱婭琴;楊慧
• 申請（專利權）人: 廈門安特奧生物工程有限公司
• 主分類號: C07D491/107
• 分類號: C07D491/107;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 廈門市誠得知識產權代理事務所(普通合伙) 35209
• 代理人: 賴開慧

技術領域

本發明涉及探針領域，特別涉及一種酸敏感雙光發射探針、制備方法及其用途。?

背景技術

真核細胞內的pH分布與細胞器特異相關。例如，細胞質是近乎中性的（pH7.2）而溶酶體內則呈酸性（pH?6.0-4.0）。溶酶體內的酸性環境對于真核細胞的內吞、自吞噬、細胞凋亡等過程有重要影響。在諸如細胞成熟、癌細胞擴散等過程中都能觀察到溶酶體酸性改變這一現象，因此檢測溶酶體pH對于相關科學研究有著重要意義。?

基于單個發光團的單熒光強度法在實際應用中有很多不足，例如樣品中探針分布不均勻，樣品厚度不均勻等原因導致難以定量測量。與此相比，比率熒光法則由于引入內參而避免了這些問題。含有分子內酰胺環的羅丹明6G衍生物在中性環境下沒有熒光，而在酸性環境中由于分子內酰胺開環會生成具有強熒光的羅丹明-酰胺，這說明這類羅丹明衍生物是一種對pH有良好響應的染料。然而，基于這種染料的小分子pH比率熒光探針還沒有報道。?

目前，市場上已經有一些通過比率測量溶酶體酸度的探針，如Lysosensor?(Invitrogen公司產品)。這類產品為含有單一熒光基團，在酸性溶液中發射兩種不同波長的熒光。??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????

發明內容

本發明的目的之一是提供一種具有雙熒光發射波長的的溶酶體酸度探針。?

本發明利用含有分子內酰胺環的羅丹明6G衍生物和丹磺酰基團對pH的不同響應性能，實現靈敏的pH比率測定。?

本發明的酸敏感雙光發射探針，其特征在于，含有分子內酰胺環的羅丹明6G和丹磺酰氯通過酰胺鍵連接在二亞乙基三胺兩端。具有如下結構：?

本發明還保護酸敏感雙光發射探針的制備方法，步驟為，先由羅丹明6G在二亞乙基三胺經過氨解得到一無色固體；再由丹磺酰氯與所得無色固體反應制備得到Danyl-R6G。

所述的無色固體經過硅膠柱分離純化步驟得到。?

所述的Danyl-R6G經過過硅膠柱分離純化步驟得到。?

制備方法具體為10?g羅丹明6G加入到100?ml?二亞乙基三胺，60攝氏度攪拌反應，直至羅丹明6G的顏色消失；向反應液中加入500?ml水，混合液用二氯甲烷萃取；保留有機相。將加熱有機相，除去溶劑所得固體用過硅膠柱分離純化，得到一無色固體；將該無色固體加入100?ml二氯甲烷,然后加入3?g丹磺酰氯與10?ml三乙胺；室溫攪拌反應2小時；加熱有機相，除去溶劑，所得固體用過硅膠柱分離純化，得到Danyl-R6G。?

本發明還保護酸敏感雙光發射探針用于檢測細胞內溶酶體pH值的用途。?

本發明提供一種具有通過能夠在細胞溶酶體內聚集的、通過含有胺基的連接臂將丹磺酰氯與含有分子內酰胺環的羅丹明6G連接在一起的探針。利用探針內羅丹明6G-內酰胺環和丹磺酰基團對pH的不同響應特性，利用含有胺基連接臂能夠富集在細胞溶酶體的特性，實現該探針在溶酶體內的富集以及溶酶體pH的比率測定。?

本發明探針的制備方法為：先由羅丹明6G在二亞乙基三胺經過氨解得到一無色固體；再由丹磺酰氯與所得無色固體反應生成丹磺酰胺-二亞乙基三胺-羅丹明6-內酰胺（簡稱Danyl-R6G）?(見圖1的Dansyl-R6G的合成路線圖)。?

所述探針檢測溶酶體pH值的應用(圖2為Dansyl-R6G的pH檢測原理)：在磷酸緩沖液環境中通過熒光放射光譜的方法檢測Danyl-R6G對pH的響應，另外對含有分子內酰胺環的羅丹明6G衍生物（簡稱為R6G-內酰胺）和丹磺酰基團(dansyl)分別在532?nm和300?nm兩個波長下進行激發檢測二者對pH的響應（圖3）。可以看到，當緩沖液pH在5.5至3.5區間變化時，波長在552?nm時激發出最優熒光強度（圖3），表明制備的Danyl-R6G通過酸性介導的內酰胺開環而使之產生強烈的熒光。其中，pH4.0時發出的熒光強度比pH?6.5強200倍。相反地，隨著緩沖液的pH從7.0降低到3.5,Danyl基團的熒光發射強度有所減弱（激發波長為300?nm)。?