[發(fā)明專(zhuān)利]一種殼聚糖修飾提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210561045.7
• 申請(qǐng)日: 2012-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103013968A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 辛瑜;夏小樂(lè);張玲;王武
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/96
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/96;C12N9/04
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種殼聚糖修飾提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

膽固醇氧化酶(COD)是膽固醇代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶，能專(zhuān)一性催化膽固醇轉(zhuǎn)化為膽甾-4-烯-3-酮，它作為一種膽固醇檢測(cè)酶應(yīng)用于醫(yī)療檢測(cè)領(lǐng)域。同時(shí)，在食品開(kāi)發(fā)、抗蟲(chóng)基因工程、生物農(nóng)藥等方面也具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。

由于膽固醇氧化酶在保存、運(yùn)輸過(guò)程中易失活，因此提高其穩(wěn)定性是該酶大量應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前，提高酶穩(wěn)定性方法主要有，蛋白質(zhì)工程、固定化、添加保護(hù)劑、化學(xué)修飾等，其中固定化是較為常用的方法。本發(fā)明中使用碳二亞胺法及戊二醛法修飾膽固醇氧化酶，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)是一種將氨基和羧基偶聯(lián)的縮合劑，載體或蛋白羧基被碳二亞胺活化，生成中間產(chǎn)物，該產(chǎn)物再與蛋白氨基反應(yīng)形成結(jié)合物；戊二醛作為雙功能試劑，廣泛應(yīng)用于酶固定化中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性的方法，本發(fā)明設(shè)計(jì)巧妙、條件溫和、易操作、成本低、環(huán)境污染小、適于大規(guī)模應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案：一種殼聚糖修飾提高膽固醇氧化酶穩(wěn)定性的方法，A、采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺交聯(lián)或B、采用戊二醛交聯(lián)，步驟為：

利用殼聚糖20000作為修飾工具，將殼聚糖的活性氨基與膽固醇氧化酶的活性氨基或羧酸基交聯(lián)；反應(yīng)時(shí)間為16-20小時(shí)，所述反應(yīng)溫度為4-10℃。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在交聯(lián)之前需要研究膽固醇氧化酶分子表面羧酸基及氨基數(shù)目，所述單個(gè)膽固醇氧化酶分子表面羧酸基數(shù)目為45個(gè)，氨基數(shù)目為60個(gè)。

較佳地，當(dāng)采取EDC交聯(lián)法時(shí)，所述酶分子游離羧酸基與殼聚糖氨基摩爾比1:10，游離羧基與EDC摩爾比為1:2，所述反應(yīng)pH為6.0。

較佳地，所述反應(yīng)時(shí)間為16-20小時(shí)，所述反應(yīng)溫度為4-10℃。

較佳地，所述反應(yīng)后使用Sepharose?4B介質(zhì)進(jìn)行分子篩層析去除為反應(yīng)物質(zhì)。

較佳地，當(dāng)采取戊二醛交聯(lián)法時(shí)，所述酶分子游離氨基與殼聚糖氨基摩爾比1:2，酶游離氨基與戊二醛摩爾比為1:2，所述反應(yīng)pH為8.0。

較佳地，所述反應(yīng)時(shí)間為16-20小時(shí)，所述反應(yīng)溫度為4-10℃。

較佳地，所述反應(yīng)后使用Sepharose?4B介質(zhì)進(jìn)行分子篩層析去除為反應(yīng)物質(zhì)。

所述固定化酶的熱、pH和存儲(chǔ)穩(wěn)定性均優(yōu)于游離酶。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明在固定前，分析了膽固醇氧化酶分子表面酸性與堿性氨基酸分布情況，便于其后進(jìn)行修飾；

2、本發(fā)明以殼聚糖20000為修飾物，通過(guò)化學(xué)合成法將其與膽固醇氧化酶連接；

3、本發(fā)明優(yōu)化了膽固醇氧化酶修飾條件，增強(qiáng)了操作的精確性。

附圖說(shuō)明

圖1是膽固醇氧化酶分子表面羧酸基分布圖。

圖2是膽固醇氧化酶分子表面氨基分布圖。

圖3是不同pH對(duì)修飾COD活力的影響。

圖4是游離羧基與EDC摩爾比及COD氨基與戊二醛摩爾比對(duì)修飾COD活力的影響。

圖5是原始酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性。

圖6是原始酶和修飾酶的pH穩(wěn)定性。

圖7是原始酶和修飾酶的存儲(chǔ)穩(wěn)定性。

具體實(shí)施方式

為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1??膽固醇氧化酶羧酸基與殼聚糖氨基摩爾比對(duì)修飾COD活力的影響：

取20-30g/L殼聚糖20000?溶液于15?mL的離心管中，按照不同膽固醇氧化酶羧基與殼聚糖氨基摩爾比?(1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:120)?加入EDC和膽固醇氧化酶的量，加入磷酸緩沖液至總體積為10mL，調(diào)節(jié)溶液pH至6.0，4-10℃、50?r/min振蕩固定16-20小時(shí)。反應(yīng)液上Sepharose?4B層析柱進(jìn)行分子篩層析，獲得經(jīng)過(guò)修飾后分子量上升的組分，測(cè)定酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力(%)。

相對(duì)酶活力（%）=[修飾酶活力/（初始酶活力－未偶聯(lián)酶活力）]×100%

將不同修飾的酶置于37℃水浴鍋內(nèi)，24小時(shí)后測(cè)定酶活力，計(jì)算酶活力保留率(%)。

酶活保留率（%）=（24小時(shí)后修飾酶活力/初始修飾酶活力）×100%

摩爾比過(guò)高，酶分子緊密堆積抑制底物與酶活性部位反應(yīng)，造成酶活力下降，所以，摩爾比1:10對(duì)穩(wěn)定性作用最佳，結(jié)果見(jiàn)表2。