[發明專利]豇豆白蛋白亞組分1b及其制備與在綠色殺蟲劑中應用

無效

• 申請號: 201210560537.4
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號: CN103059113A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 張毅;林曉珊;蔣波;王玉海;岳娟
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/81;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16;A01N47/44;A01P7/04;C12R1/84
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞;裘暉

1.一種豇豆白蛋白亞組分1b，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.編碼權利要求1所述的豇豆白蛋白亞組分1b的核苷酸序列SEQ?ID?NO.2所示。

3.權利要求1所述的豇豆白蛋白亞組分的制備方法，其特征在于包含以下步驟：

（1）重組蛋白生產的基因工程菌株構建：

以豇豆cDNA文庫為模板，以上游引物Xho?Ⅰ-PA-F和下游引物NotⅠ-PA-R為引物對，進行PCR擴增獲得目的基因片段，目的基因片段與畢赤酵母表達載體pPICZα經內切酶Xho?Ⅰ和Not?Ⅰ雙酶切后連接，構建表達產物的重組質粒pPICZα-1b；重組質粒pPICZα-1b經Sal?Ⅰ處理成線狀后，采用電轉化的方法將其導入畢赤酵母細胞GS115，在含Zeocin選擇壓力的YPD培養基中，篩選具有目的蛋白表達能力的基因工程轉化菌株；

上游引物Xho?Ⅰ-PA-F：5′-CTC?TCG?AGA?AAA?GAG?AGG?CTG?CTT?CTTGCA?ACG?GTG?TTT?G-3′；

下游引物Not?Ⅰ-PA-R：5′-GAT?CTC?AGT?GGT?GGT?GGT?GG-3′；

（2）豇豆白蛋白亞組分1b重組蛋白的發酵生產：

①富集菌體：將步驟（1）得到的基因工程轉化菌株接種到MGYH液體培養基中，在25～30℃下培養至OD600為2.6，得到發酵液；將發酵液離心，收集細胞；

②誘導重組蛋白表達：用BMMH液體培養基懸浮步驟①得到的細胞至OD600為0.1，繼續培養，誘導抗蟲蛋白表達，每24h添加甲醇，保持甲醇在培養體系中的終濃度為體積百分比0.5%，維持誘導壓力，促使重組蛋白表達；

（3）豇豆白蛋白亞組分1b重組蛋白的分離純化：將步驟（2）經甲醇誘導重組蛋白表達的發酵液離心除去細胞后，上清液采用截留分子量10K的超濾膜分離，濾液采用HPLC分離，HPLC分離條件如下：色譜分離柱為5μNucleosil-300C18，洗脫液為含體積百分比0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，其中乙腈溶液為線性梯度，乙腈起始濃度為體積百分比20%，終濃度為體積百分比99.9%，總洗脫時間為60min，流速1ml/min，收集滯留時間為28～30min的分部組分，真空干燥，得到豇豆白蛋白亞組分1b重組蛋白；

步驟（2）中所述的MGYH液體培養基的組成如下：質量體積比1.34%的YNB，質量體積比1%的甘油，450μg/L生物素，質量體積比0.004%的組氨酸；

步驟（2）中所述的BMMH液體培養基的組成如下：100mmol/L磷酸鈉，pH6.0，質量體積比1.34%的YNB，450μg/L抗生素博萊霉素，體積百分比0.5%的甲醇和質量體積比0.004%的組氨酸。

4.根據權利要求3所述的豇豆白蛋白亞組分的制備方法，其特征在于：步驟（1）中所述的PCR的條件如下：94℃5min；94℃60s、55℃50s、72℃50s，35個循環；72℃10min。

5.根據權利要求3所述的豇豆白蛋白亞組分的制備方法，其特征在于：步驟（1）中所述的畢赤酵母表達載體pPICZα為pPICZα-A、pPICZα-B或pPICZα-C。

6.權利要求1所述的豇豆白蛋白亞組分1b在制備綠色殺蟲劑中的應用。

7.一種豆科植物源性儲糧害蟲無公害綠色殺蟲劑，其特征在于，含有權利要求1所述的豇豆白蛋白亞組分1b，所述的豇豆白蛋白亞組分1b在所述的豆科植物源性儲糧害蟲無公害綠色殺蟲劑的含量為質量百分比0.02～0.10%。

8.根據權利要求7所述的豆科植物源性儲糧害蟲無公害綠色殺蟲劑，其特征在于包含以下按質量百分比計的成分：所述的豇豆白蛋白亞組分1b??0.02～0.10%、木質素磺酸鹽5.0～15.0%、拉開粉10.0～25.0%、苯甲酸鈉1.0～2.0%、淀粉50.0～85.0%。

9.根據權利要求7所述的豆科植物源性儲糧害蟲無公害綠色殺蟲劑，其特征在于：所述的淀粉為小麥面粉。

10.權利要求7所述的豆科植物源性儲糧害蟲無公害綠色殺蟲劑的制備方法，其特征在于包含以下步驟：

（1）將豇豆白蛋白亞組分1b溶解于0.05mol/L、pH6.0的磷酸鹽緩沖液中，然后加入淀粉混勻，制成顆粒，室溫放置過夜干燥；

（2）在步驟（1）干燥后的顆粒中加入木質素磺酸鹽、拉開粉和苯甲酸鈉，混勻后，粉碎，得到豆科植物源性儲糧害蟲無公害綠色殺蟲劑；

其中，各成分的質量百分含量如下：豇豆白蛋白亞組分1b?0.02～0.10%、木質素磺酸鹽5.0～15.0%、拉開粉10.0～25.0%、苯甲酸鈉1.0～2.0%、淀粉50.0～85.0%。