[發明專利]多形漢遜酵母突變菌株及其在谷胱甘肽生物合成中的應用

有效

• 申請號: 201210560069.0
• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號: CN103060210A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 錢衛東;付云芳;蔡長龍;齊香君
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N13/00;C12N15/01;C12P21/02;C12R1/645
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 汪人和

技術領域

本發明屬于工業微生物領域，具體涉及一種低能離子誘變多形漢遜酵母突變菌株及其在谷胱甘肽生物合成中的應用。

背景技術

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是一種廣泛存在于生物體內的活性三肽，含有γ-谷氨酰基和巰基，可參與多種生物學反應，對于維持生物體內適宜的氧化還原環境具有重要作用。由于GSH具有解毒，抗氧化和防衰老等重要生理功能，在臨床，醫藥，食品加工以及化妝品等領域具有廣闊的應用前景。

多年來，國外對GSH的生物合成研究較多，并將基因工程菌株應用于GSH的生產，目前其GSH的產量基本壟斷中國市場。與國外相比，國內對GSH生物合成研究甚少、起步也較晚，并且用于生產GSH菌種的發酵水平低，生產設備及產品的后續提取工藝落后，產品收率低，這是目前高效發酵生產GSH的主要瓶頸之一，也是影響企業經濟效益的最根本因素。為解決上述問題，首先迫切需要選育出發酵生產GSH水平高的突變菌株

目前，發酵GSH所用菌種最為常見的是酵母菌，其中釀酒酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬和裂殖酵母屬胞內谷胱甘肽含量較高。多形漢遜酵母（H.polymorphaDL-1）是一種耐熱酵母，最高生長溫度達49℃，其具有如下優點如生長、分裂速度較快，生存力強，易于高密度發酵培養，能在廉價的合成或半合成培養基上高密度生長。這不僅可以縮短發酵時間，降低對發酵設備的制冷要求，而且可以減少大規模培養時污染的風險。但野生型多形漢遜酵母細胞中GSH的含量并不高。

20世紀90年代，低能離子注入技術逐漸應用于工業微生物選育，與常規誘變育種方法如紫外線、X射線、γ射線以及亞硝基胍等方法相比，低能離子注入技術表現出對靶物質損傷小，技術操作簡單，突變頻率高，突變譜廣等優點。目前，利用離子注入進行微生物菌種改良已在生產實踐中得到廣泛的應用，并取得了顯著的經濟效益和社會效益。同時，以微生物為實驗對象進一步對離子注入的誘變機理進行研究，不僅可以指導微生物菌種改良，也可以深入地解析注入離子與生物體的作用機制，為離子注入的廣泛應用提供理論基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種多形漢遜酵母突變菌株及其在谷胱甘肽生物合成中的應用，該突變菌株具有耐高溫、生存能力強，易培養等優點，是一種GSH高產菌株。

為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：

一種多形漢遜酵母突變菌株，該菌株的命名為HansenulapolymorphaDL-18，所述菌株保藏于CGMCC，保藏編號為CGMCC?No.6642。

所述突變菌株的誘變方法為低能離子輻照方法。

所述低能離子輻照的出發菌株為多形漢遜酵母ATCC?No.26012。

所述低能離子輻照采用低能N+作為誘變源，最佳注入劑量為1.5×10¹⁶~2.5×10¹⁶ions/cm²，最佳注入能量為15~25KeV。

所述突變菌株的抗性篩選培養基為添加Zn²⁺的YPD培養基，Zn²⁺的添加濃度為800~1500mg/L。

上述多形漢遜酵母突變菌株在谷胱甘肽生物合成中的應用。

所述生物合成為發酵培養，發酵培養過程中首先于40～49℃培養10～16h，然后將培養溫度降低為30～40℃繼續培養36～40h。

本發明誘變GSH高產菌株的方法，主要依據低能離子注入誘導受體細胞突變原理，對H.polymorphaDL-1進行誘變。首先，將保存的菌株在37℃活化8-10h后，經種子培養，取一定量處于對數生長期的種子，通過血球計數板計數確定稀釋倍數，使菌體濃度為1.0×10⁷CFU/ml。其次，制作菌膜，無菌風吹干后用離子束生物工程改性設備進行離子注入，接著在恒溫培養箱中37℃溫浴兩小時后，接種于YPD培養基，37℃培養72h。通過實驗設計確定最佳的離子注入劑量及能量。最后，通過Zn²⁺抗性篩選GSH高產菌株，并進行傳代培養檢測其遺傳穩定性，收獲細胞后測定胞內、發酵液中GSH含量及發酵液中殘留糖量。

本發明篩選獲得了一種高產GSH菌株，命名為HansenulapolymorphaDL-18，該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所），保藏日期為2012年9月29日；保藏編號為CGMCC?No.6642；分類命名為Hansenulapolymorpha。