[發明專利]穩定的NAD/NADH衍生物

有效

• 申請號: 201210559220.9
• 申請日: 2006-07-28
• 公開（公告）號: CN103122371A
• 公開（公告）日: 2013-05-29
• 發明（設計）人: J.霍恩斯;D.海因德爾;C.霍恩;C.加斯勒－迪特謝
• 申請（專利權）人: 霍夫曼－拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/54
• 分類號: C12Q1/54;C12Q1/32;C12Q1/60;C12Q1/61;C12Q1/34;C12Q1/50
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李慧惠;林森

本申請是申請號為200680027359.1的中國專利申請的分案申請，要求2005年7月28日的優先權。

技術領域

本發明涉及穩定的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)衍生物、這些衍生物的酶配合物和它們在生物化學檢測方法和試劑盒方面的用途。

背景技術

生物化學分析學的測量系統是臨床相關分析方法的重要部分。這主要涉及直接或者間接在酶的輔助下進行測定的分析物的測定，例如代謝物或者底物。該分析物在酶-輔酶配合物的輔助下進行轉化，和隨后進行定量測定。在該方法中，預測定的分析物與適宜的酶和輔酶接觸，其中酶主要以催化量使用。通過酶反應，輔酶得到改變，例如被氧化或者還原。該方法可以直接或者通過介體得到電化學或者光度檢測。標定提供了意欲進行測定的分析物的測量值和濃度之間的直接相關性。

輔酶是共價或者非共價與酶連接的有機分子，并且通過分析物的轉化得到改變。輔酶的突出實例為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，通過還原它們分別形成NADH或NADPH。

現有技術已知的測量系統的特征在于在時間上有限的貯存期限，和為了獲得該儲存期限，對環境有特殊要求，比如，冷卻或者干燥儲存。由此，由不正確的、未注意的、不完善的存儲導致的錯誤結果對于某些應用形式可能存在，例如，在其中最終用戶自身進行測試的情形中，比如葡萄糖自我監控。特別是，由于開放初始包裝過長時間導致干燥劑耗盡，會導致測量誤差，該測量誤差在一些系統中，消費者幾乎不能辨認。

可以用于升高生物化學測量系統穩定性的已知測量是使用穩定的酶，例如，使用得自于喜溫有機體的酶。還可以通過化學修飾使酶穩定，例如交聯或者誘變。此外，還可以將酶穩定劑(比如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清清蛋白)加入或者將酶包裝入聚合物網絡中，例如通過光致聚合作用。

還意圖通過使用穩定的介體改良生物化學測量系統的儲存期限。由此，通過使用具有最低可能氧化還原電勢的介體，測試的特異性會升高和反應期間的干擾會被消除。然而，酶/輔酶配合物的氧化還原電勢構成了介體的氧化還原電勢的下限。如果降低到該下限之下，與介體的該反應將被延遲，或者甚至被阻止。

另外地，還可以使用無介體的生物化學測量系統，其中，對輔酶(比如輔酶NADH)直接進行檢測。然而，所述測量系統的缺點是比如NAD和NADP的輔酶是不穩定的。

NAD和NADP是堿不穩定(basenlabile)的分子，其降解途徑描述在文獻(N.J.Oppenheimer?in?The?Pyridine?Nucleotide?Coenzyms?AcademicPress，New?York，London?1982，J.Everese，B.Anderson，K.You，Editors，Chapter?3，第56-65頁)中。ADP-核糖基本上在NAD或者NADP通過裂解核糖和吡啶單元之間的糖基鍵接的降解期間形成。然而，還原形式的NADH和NADPH對酸不穩定：例如，差向異構化是已知的降解途徑。在上述兩種情形中，NAD/NADP和NADH/NADPH的不穩定性是由于核糖和吡啶單元之間的糖基鍵的不穩定性。但是，即使在并不劇烈的條件下(比如在含水溶液中)，輔酶NAD或NADP僅僅通過環境濕度進行水解。當測量分析物時，該不穩定性會導致不精確。

一系列NAD/NADP衍生物描述在，例如，B.M.Anderson?in?thePyridine?Nucleotide?Coenzymes，Academic?Press?New?York，London?1982，J.Everese，B.Anderson，K.You，Editors，Chapter?4中。然而，酶對這些衍生物中的大多數接受并不良好。為此，先前用于診斷性測試的唯一衍生物是3-乙酰基吡啶腺嘌呤二核苷酸(乙酰基NAD)，其最早描述在1956年(N.O.Kaplan，J.Biol.Chem.(1956)，221，823)。還表明酶對該輔酶的接受低，并且該輔酶在氧化還原電勢上表現出變化。

其它具有修飾吡啶基團的NAD衍生物的使用描述在WO?01/94370中。然而，煙酰胺基團的修飾通常對催化反應具有直接影響。在大多數情形中，該影響是負的。