[發(fā)明專利]定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒及其應用

無效

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• 申請日: 2012-12-20
• 公開（公告）號: CN103033630A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發(fā)明（設計）人: 汝少國;王軍;王蔚;田華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531;G01N21/78
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領域，具體涉及一種定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒及其應用。

背景技術(shù)

魚類的發(fā)育分為仔魚期、稚魚期、幼魚期、未成熟期、成魚期和衰老期，各時期的劃分與魚類性腺的發(fā)育有著直接的關(guān)系，對于雌魚而言，其卵巢中主要的物質(zhì)為卵黃蛋白，卵黃蛋白在魚類整個生命周期中起著重要的作用。首先，卵黃蛋白是受精卵的重要物質(zhì)，為魚類胚胎發(fā)育和仔魚早期生長提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源。其次，在卵黃生成期，卵細細胞從血液中攝取卵黃原蛋白，經(jīng)加工后以卵黃粒和油滴的形式儲存于卵母細胞中，卵黃蛋白的含量直接影響胚胎的存活及仔魚的生長發(fā)育。

卵黃原蛋白由雌魚的肝臟產(chǎn)生，隨血液循環(huán)到達卵巢，在組織蛋白酶D的作用下，迅速裂解成三種主要卵黃蛋白：卵黃脂磷蛋白、卵黃高磷蛋白和β’組分，儲存于卵黃粒中，其中以卵黃脂磷蛋白的含量最為豐富。與卵黃原蛋白相似，卵黃脂磷蛋白也是一種典型的糖脂蛋白，并且含有少量的磷，在胚胎的生長和發(fā)育過程中具有多種生物學功能。在卵母細胞的成熟過程中，卵黃脂磷蛋白進一步裂解，釋放出脂質(zhì)，并產(chǎn)生游離氨基酸，為胚胎與稚魚提供蛋白質(zhì)合成的原料和有氧能量生產(chǎn)的主要底物，并且在特定的發(fā)育時期提供所需的脂質(zhì)。目前已經(jīng)研究了黑線鱈、條斑星鰈、雜交鱘等多種魚類卵黃脂磷蛋白在卵母細胞或胚胎發(fā)育過程中變化，并證實卵黃脂磷蛋白通過降解成游離氨基酸，為早期胚胎和稚魚的發(fā)育提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)；卵黃脂磷蛋白還具備調(diào)節(jié)滲透壓的功能，在卵細胞的發(fā)育過程中，浮性卵因吸收水分，體積顯著增大，發(fā)育成熟時，浮性卵中水分含量達到85~95%,卵細胞體積增大3~5倍，為胚胎的發(fā)育提供備用水。在這一過程中，游離氨基酸含量的增加，為產(chǎn)生水分流入所需要的滲透壓起到重要作用，同時，水含量的增加提供了魚卵漂浮在水體中所需的浮力。Reith等(2001)、Reading等(2009)和Ohkubo等(2006)證實，浮性卵中的游離氨基酸主要來源于卵黃脂磷蛋白的重鏈；此外，卵黃脂磷蛋白還具備免疫學功能，在大多數(shù)情況下，魚類的受精和發(fā)育要在水環(huán)境中進行，而水中往往含有能夠引起多種疾病的病原體，在發(fā)育初期，胚胎和稚魚無法合成足夠的免疫相關(guān)分子，也未形成淋巴器官。因此，在免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟之前，只能依靠母系物質(zhì)抵擋入侵的病原菌。師曉棟(2003)發(fā)現(xiàn)玫瑰無須鲃的卵黃脂磷蛋白能夠抵制多種病原菌的生長；Zhang?J和Zhang?SC(2011)研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰無須鲃的卵黃脂磷蛋白與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有很強的結(jié)合能力，并能能夠增強巨噬細胞的吞噬能力，推測卵黃脂磷蛋白既能夠識別入侵的病原菌，又能誘發(fā)巨噬細胞消化病原菌，從而保護胚胎和稚魚免受病害。

可見，研究魚類的卵黃脂磷蛋白對了解魚類早期發(fā)育狀況具有極大幫助。目前，國內(nèi)外已經(jīng)報道了多種魚類卵黃脂磷蛋白的純化與鑒定方法，但大多采用其含有糖、磷、脂基團的特性，采用特異性染色或者分析其糖、磷、脂含量來確定其是否為卵黃脂磷蛋白。這種方法是費時、費力，并且非常不經(jīng)濟。

鯉科魚類是鯉形目中分布最廣、種類也最多的一群，全世界共有鯉科魚類210屬，2000種以上，都是淡水魚類，在我國各大河流、湖泊中廣泛分布，也是我國自古以來農(nóng)家魚塘中主要的養(yǎng)殖魚種。因此，開發(fā)鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的檢測試劑盒具有廣泛的應用前景和科學價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒及其應用，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

一種定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒，包括一個盒體，該盒體內(nèi)裝有：1)PVDF膜2張；2)辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗1支；3)封閉液、洗滌液、顯色液各1支，所述的洗滌液為TBST；封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST；顯色液為含0.06%(m/V)3’-二氨基聯(lián)苯胺的10mM?Tris-HCl；其特征在于該盒體還裝有：4)金魚卵黃脂磷蛋白純品1支；5)鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體1支。

上述金魚卵黃脂磷蛋白純品為100μg/ml金魚卵黃脂磷蛋白溶液。

上述定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白的試劑盒制備方法，包括以下步驟：1)制備金魚卵黃脂磷蛋白純品；2)利用步驟1)得到的金魚卵黃脂磷蛋白純品制備鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗體；3)將步驟1)得到的金魚卵黃脂磷蛋白純品1支、步驟2)得到的鼠抗金魚卵黃脂磷蛋白多克隆抗血清1支、PVDF膜2張，以及封閉液、洗滌液、顯色液和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗1支共同裝入盒體，得到鯉科魚類卵黃脂磷蛋白定性檢測的試劑盒。

上述試劑盒在定性檢測鯉科魚類卵黃脂磷蛋白中的應用。