[發明專利]低殘留無機-有機雜化整體基質固定化酶反應器及其制備有效

申請號：	201210555716.9	申請日：	2012-12-19
公開（公告）號：	CN103881999A	公開（公告）日：	2014-06-25
發明（設計）人：	張麗華;袁輝明;陳玲凡;楊開廣;張玉奎	申請（專利權）人：	中國科學院大連化學物理研究所
主分類號：	C12N11/08	分類號：	C12N11/08;C08G81/02;C08F220/06;C08F230/08;C08F8/00
代理公司：	沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002	代理人：	馬馳
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摘要：
搜索關鍵詞：	殘留無機有機整體基質固定反應器及其制備
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種低殘留無機-有機雜化整體基質固定化酶反應器，可用于蛋白質的低殘留、快速酶解。

背景技術

在以肽段指紋譜和二級質譜肽段測序為基礎的蛋白質組學分析方法中，蛋白質酶解是非常重要的樣品預處理步驟。然而，常用的自由溶液酶解方法具有酶解時間長、酶不能重復利用、易自降解等諸多缺點。近年來，為了克服這些問題，人們將蛋白酶固定在不同的基質上，制備成固定化酶反應器(IMER,immobilized?enzymatic?reactor)，從而提高蛋白質的酶解效率，避免蛋白質樣品的手工操作，減少了蛋白質樣品被污染的可能性。目前，多種材料均被應用于酶的固定化，如納米材料(Qiao,L.,et.al?Chem.Eur.J.2008,14,151-157)、膜材料(Cooper，J.W.,et.al?Anal.Chem.2003,75,1067-1074.)以及整體材料（Ma,J.F.,et.al.Anal.Chem.2008,80,2949-2956.）等。

在上述材料中，雜化硅膠整體柱的IMER因其比表面積大、傳質速度快，且表面易改性等諸多優點，是理想的固定化蛋白酶載體。然而，盡管相比硅膠整體柱而言，雜化硅膠整體柱表面的硅羥基得到一定程度的抑制，但其對蛋白質的非特異性吸附仍然無法完全避免。因此，針對傳統雜化硅膠整體基質酶反應器存在的問題，我們發展了一種低殘留無機-有機雜化整體基質固定化酶反應器。該酶反應器不僅可以實現高通量的蛋白質酶解，而且還可以改善蛋白質在處理過程中的回收率，在蛋白質組學研究中具有很好的應用前景。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種低殘留無機-有機雜化硅膠整體基質固定化酶反應器。該酶反應器不僅可以實現高通量的蛋白質酶解，而且還可以改善蛋白質在處理過程中的回收率。為了實現該目的，本發明的技術方案是：

1）四甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、聚乙二醇在酸性溶液中混合，0℃攪拌制得反應溶液A;

其中四甲氧基硅烷的加入量占反應溶液A的質量百分數范圍為10%-30%，乙烯基三甲氧基硅烷的加入量占反應溶液A的質量百分數范圍為3%-10%，聚乙二醇的加入量占反應溶液A的質量百分數范圍為5%-20%，酸性溶液的加入量占反應溶液A的質量百分數范圍為40%-80%；

2)在反應溶液A中加入甲基丙烯酸，在無水乙醇-氨水混合體系混合，加入引發劑，除氣，在35-60℃進行加熱聚合反應不少于12小時；得到具有多孔結構的雜化剛性基質

其中甲基丙烯酸的加入量為反應溶液A質量數的5%-20%；所加入的無水乙醇為反應溶液A質量數的40%-80%，所加入的氨水為反應溶液A質量數的1-5倍,

加入的引發劑為過硫酸銨（APS）或偶氮異丁腈（AIBN），其加入量為四甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷和甲基丙烯酸三種單體加入總質量的0.5%-2%；

3）雜化剛性基質表面引入親水活性反應基團，具體步驟如下：

采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)于緩沖液中活化基質表面羧基，再加入親水性的聚乙烯亞胺（PEI），活化的羧基再與親水性的聚乙烯亞胺（PEI）室溫反應不少于4小時，得到親水性的固載基質；

其中EDC/NHS的質量比范圍1/1-1/10；EDC于緩沖液中濃度1-20mg/mL

采用PEI的終濃度范圍為1-15mg/mL；

4）雜化基質表面固定蛋白質酶，具體步驟如下：