[發(fā)明專利]抗C肽單克隆抗體及其在檢測C肽含量中的用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210555678.7
• 申請日: 2012-12-19
• 公開（公告）號: CN103074302A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 不公告發(fā)明人
• 申請（專利權(quán)）人: 北京利德曼生化股份有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/18;G01N33/68;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及單克隆抗體,尤其涉及配對的抗C肽單克隆抗體以及分泌該抗C肽單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,本發(fā)明進一步涉及它們在制備檢測或診斷C肽的試劑或藥物中的用途,屬于C肽的檢測或診斷領(lǐng)域。

背景技術(shù)

C肽（C-Peptide）又稱連接肽，是胰島β細(xì)胞的分泌產(chǎn)物，它與胰島素有一個共同的前體——胰島素原。一個分子的胰島素原經(jīng)酶切后，裂解成一個分子的胰島素和一個分子的C肽。測定C肽能得知胰島細(xì)胞的功能，對糖尿病的診斷和治療具有很大的意義，C肽沒有胰島素的功能，而胰島β細(xì)胞分泌的胰島素和C肽呈等分子關(guān)系，這也就是說，分泌幾個胰島素分子，同時必然分泌幾個C肽分子。血中C肽濃度可間接反應(yīng)胰島素濃度。C肽不受肝臟酶滅活，半衰期比胰島素長，經(jīng)腎臟直接在尿中排泄，故血中C肽的濃度可更好地反映胰島的功能。C肽的清除主要通過腎臟降解和排泄，C肽在尿中的濃度高于血漿中的濃度。治療用的胰島素不含C肽，因此，C肽不受外源性胰島素的影響，這是在研究胰島β細(xì)胞功能方面比胰島素優(yōu)越之處。C肽釋放試驗在某種意義上可代替胰島素釋放試驗，可用于正接受胰島素治療的患者，C肽濃度的測定是診斷和理解糖尿病臨床狀況的有用指標(biāo)。

C肽由31個氨基酸殘基構(gòu)成，分子較小，通過多肽合成的方式得到的C肽穩(wěn)定性很差，容易降解，無論做為免疫抗原或篩選抗原均不合適。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供相互配對的兩種抗C肽單克隆抗體;

本發(fā)明的目的之二是提供分泌所述抗C肽單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株;

本發(fā)明目的之三是將所述的抗C肽單克隆抗體應(yīng)用于診斷或檢測C肽;

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:

本發(fā)明采用C肽-GST做免疫原，C肽-Trx做為篩選抗原，篩選獲得2株雜交瘤細(xì)胞株，3G1和5F7；采用C肽-Trx做免疫原，C肽-GST做為篩選抗原，篩選獲得3株雜交瘤細(xì)胞株，2A9，5C8和5B12。

本發(fā)明通過進一步的試驗發(fā)現(xiàn)采用C肽-GST做免疫原篩選得到的雜交瘤細(xì)胞株5F7所分泌的單克隆抗體和采用C肽-Trx做免疫原篩選得到的雜交瘤細(xì)胞株5B12所分泌的單克隆抗體，二者之間能夠相互配對，作為一對配對的單抗克隆抗體，通過雙抗夾心ELISA法應(yīng)用于檢測C肽，檢測結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏度。

本發(fā)明將雜交瘤細(xì)胞株5F7提交專利認(rèn)可的機構(gòu)進行保藏；其微生物保藏編號為：CGMCC?NO.6804；保藏時間為：2012年?11月9?日；其分類命名為：C肽單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株；保藏單位：中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址：中國北京朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。

本發(fā)明將雜交瘤細(xì)胞株5B12提交專利認(rèn)可的機構(gòu)進行保藏；其微生物保藏編號為：CGMCC?NO.6805；保藏時間為：2012年?11月?9日；其分類命名為：C肽單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株；保藏單位：中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址：中國北京朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。

本發(fā)明采用大腸桿菌表達(dá)的帶有兩種不同標(biāo)簽的C肽融合蛋白，解決C肽分子量小、不穩(wěn)定的問題。采用兩種融合蛋白分別做為抗原，免疫小鼠，采用兩種抗原交叉進行篩選，既避免了得到抗標(biāo)簽的單抗，又增加了得到抗不同表位單抗的機會，從而增加了可用于夾心法檢測C肽的配對單抗的機會。

對于一種穩(wěn)定性差的多肽C肽，采用兩種不同標(biāo)簽，表達(dá)兩種帶有目的蛋白的融合蛋白，經(jīng)已有的免疫學(xué)反應(yīng)檢測，可以與已有的特異性抗體反應(yīng)；采用其中一種融合蛋白做為免疫原，用另外一種融合蛋白做為篩選用抗原，獲得單克隆抗體，并進行配對實驗。由于表達(dá)融合蛋白的分子伴侶不同，蛋白的構(gòu)象可能有所差異，從而可能得到針對不同表位的單抗，使配對成功的機會增加。

本發(fā)明通過表達(dá)兩種不同標(biāo)簽的融合蛋白分別用于免疫和檢測，使得到配對單抗的幾率增加，進而得到了抗不同表位的能力，從而增強了檢測C肽的敏感性和準(zhǔn)確性。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明將得到的兩種帶有標(biāo)簽的融合蛋白作為免疫原，由于不同標(biāo)簽融合蛋白的蛋白構(gòu)象不同，其增加了抗不同表位抗體產(chǎn)生的機會；以帶有與免疫原不同標(biāo)簽的融合蛋白作為篩選抗原，避免了C肽不穩(wěn)定造成的篩選結(jié)果不穩(wěn)定。同時,使用GST和Trx作為標(biāo)簽，可增加蛋白的可溶性及穩(wěn)定性，且便于純化。

附圖說明

圖1?為制備配對抗體的流程圖。

圖2?為以5F7/5B12作為配對抗體進行雙抗夾心ELISA檢測C肽的結(jié)果。

具體實施方式