[發明專利]一種分離純化肝素鈉的方法有效
| 申請號: | 201210555008.5 | 申請日: | 2012-12-07 |
| 公開(公告)號: | CN103030715A | 公開(公告)日: | 2013-04-10 |
| 發明(設計)人: | 夏襯來;遲培升;刁愛芹 | 申請(專利權)人: | 青島九龍生物醫藥有限公司 |
| 主分類號: | C08B37/10 | 分類號: | C08B37/10 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 一種 分離 純化 肝素鈉 方法 | ||
技術領域
本發明涉及一種分離純化肝素鈉的方法,特別是一種肝素鈉生產工藝方法。
背景技術
肝素鈉是一種臨床常用的抗凝血藥物,主要從豬小腸粘膜中提取的粘多糖物質,具有顯著地抗凝血和防止血栓形成的作用。近年來低分子肝素鈉的涌現,使肝素鈉的應用越來越廣泛。傳統的生產工藝方法是將粗提取的肝素鈉(效價60-100U/mg)進行鹽解或酶解,然后進行氧化脫色精制。其局限性在于,核酸及蛋白質類雜質去除程度低,對提取質量要求高(要求效價≥80U/mg),生產周期長,產品效價低,收率低。
發明內容
本發明的目的提供一種新的酶解結合絮凝沉降生產肝素鈉的工藝方法,克服了上述常規方法存在的問題,有效簡化精制工序,可在更短的時間里生產出雜質含量低、單位效價高、收率好的肝素鈉產品。
本發明的目的通過以下技術方案來達到,依次通過以下幾個步驟來實現。
1、將肝素鈉加入到反應罐中用水完全溶解,肝素鈉與水的重量比為1∶6至1∶8;
2、調pH=6.0-7.0,升溫至50-55℃,按5-10g/億單位加入胃蛋白酶,按10-20g/億單位加入胰蛋白酶,酶解保溫2-4小時;
3、調pH=8.0-9.0,升溫至80-90℃,靜置20至40分鐘,然后降溫至50-55℃,按20%至30%(v/v)比例加入乙醇,調節pH=11.0-12.0,靜置直至分層;
4、虹吸酶解上清液,下層沉淀物離心后母液合并至上清液中,棄去固體分離物。
5、調pH=6.0-7.0,升溫至60-70℃,按0.3%-0.5%(w/v)比例加入絮凝沉淀劑1,攪拌均勻后,靜置直至分層,虹吸上清,沉淀物離心后母液合并至上清液中,棄去固體分離物。
6、升溫至40-50℃,調pH=11.0-12.0,按0.3%-0.5%(w/v)比例加入絮凝沉淀劑2,靜置直至分層,虹吸上清,沉淀物離心后母液合并至上清液中,棄去固體分離物。
7、將步驟6中的上清液用乙醇沉淀,之后用過氧化氫氧化脫色,脫水后烘干,即得分離純化的肝素鈉。
本技術方案的有益效果是:經酶解結合絮凝沉降工藝方法分離純化的肝素鈉,經過氧化氫一步氧化脫色并用乙醇沉淀精制后,活性效價的回收率≥85%,效價≥180U/mg,吸光度260nm≤0.1,280nm≤0.1。
第一,本技術方案中,酶解保溫pH=6.0-7.0,保溫溫度為50-55℃。酶解條件溫和,在裂解核酸及蛋白雜質的同時,可有效保護肝素鈉較少受蛋白酶的破壞。傳統酶解保溫pH=8.0-9.0,此時胰蛋白酶的活性最好,但此時對肝素鈉的分解作用增加,活性效價損失大。
第二,本技術方案中,酶解液降溫至50-55℃后,按20%-30%(v/v)比例加入乙醇,可使靜置分層效果更好,使上清液的比例增加。
第三,本技術方案中,酶解液中仍存在未變性的蛋白多肽等雜質,使用絮凝沉淀劑1進行處理,可有效分離酸性蛋白多肽雜質。
第四,本技術方案中,酶解液中仍存在與堿性蛋白相結合的核酸等雜質,使用絮凝沉淀劑2進行處理,可有效分離堿性蛋白核酸等雜質。
具體實施方式
以下實例詳細說明了本發明:
1、向反應罐中加入800Kg水,邊攪拌邊將100Kg肝素鈉(60U/mg)加入到反應罐中直至完全溶解。
2、調pH=6.0,升溫至55℃停止加熱,加入600g胃蛋白酶及1200g胰蛋白酶,攪拌均勻后保溫作用3小時。
3、調pH=9.0,迅速升高溫度至90℃,靜置30分鐘。降溫至55℃,加入160L95%乙醇,調節pH=11.0,靜置12小時。
4、虹吸酶解上清液,下層沉淀物離心,合并母液至上清,棄去固體分離物。
5、將4中的料液調pH=7.0,升高溫度至70℃,加入2.4Kg絮凝沉淀劑1(碳酸鈣),攪拌均勻后,靜置12小時。虹吸上清,沉淀物離心后,將母液合并至上清,棄去固體分離物。
6、將5中的料液升溫至50℃,調pH=11.0,加入絮凝沉淀劑2(羥基磷灰石),靜置12小時,虹吸上清,沉淀物離心后,將母液合并至上清,棄去固體分離物。
7、將6中的合并上清用95%乙醇沉淀至40%,之后用過氧化氫氧化脫色,脫水后烘干,得分離純化的肝素鈉30Kg。
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