[發(fā)明專利]利用改進的目的基因表達盒進行植物轉化的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210554803.2
• 申請日: 2012-12-19
• 公開（公告）號: CN103045648A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設計）人: 陳明;徐惠君;馬有志;徐兆師;李連城;蘇瑞波;杜麗璞
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發(fā)明涉及一種轉化植物的方法，特別涉及一種將目的基因以DNA片段的形式（含有目的基因表達盒）導入目的植物中的方法。

背景技術

基因槍轉化法具有轉化效率高、無宿主限制、簡單易操作等優(yōu)點，在小麥轉化中得到廣泛應用，目前小麥遺傳轉68.8%是采用基因槍轉化。而傳統(tǒng)的小麥基因槍轉化法多以環(huán)形載體轉化為主，導致載體骨架序列伴隨目的基因同時整合進植物基因組，外源片段拷貝數(shù)高，目的基因的低表達甚至外源基因沉默，同時，載體框架序列中含有的抗生素抗性基因增加了轉基因植物的安全隱患。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，載體骨架序列會引起外源基因發(fā)生不同程度的重排、斷裂，導致遺傳不穩(wěn)定。早在1991年，Artelt等就指出，載體框架結構在轉基因中都會產(chǎn)生負面影響，因此需要對經(jīng)典的基因槍法進行改進和創(chuàng)新。

Uzé等（Uzé,M,Potrykus,I?and?Sautter,C.Single-stranded?DNA?in?the?genetictransformation?of?wheat(Triticum?aestivum?L.):transformation?fequency?and?intergrationpattern.Theor?Appl?Genet,1999,99:487-495）在小麥中比較了Bar和GUS基因的環(huán)形質(zhì)粒和最小表達框（包括啟動子、目的基因編碼序列和終止子）的轉化效率，結果表明線性最小表達框的轉化效率高于環(huán)形載體。然而，目前國際上用最小表達框轉化法獲得轉基因小麥的成功報道還很有限，如何進一步提高最小表達框轉化技術的轉化效率，提高轉化基因的表達效率及穩(wěn)定性仍然需要研究。

核基質(zhì)結合區(qū)SAR（Scaffold?Attachment?Region）可作為DNA的邊界元件與核基質(zhì)結合，使兩個SAR之間的基因片段被界定成一個獨立的染色質(zhì)環(huán)狀結構，從而阻擋鄰近染色質(zhì)區(qū)的作用與影響，可以提高外源基因的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種轉化植物的方法。

本發(fā)明所提供的轉化植物的方法，包括將目的基因導入目的植物中的步驟；所述目的基因是通過如下DNA片段（含有目的基因表達盒）導入目的植物中的（即導入目的植物中的是線性的DNA片段）：

5’-核基質(zhì)結合區(qū)序列-啟動子-目的基因-終止子-核基質(zhì)結合區(qū)序列-3’，即所述DNA片段從上游至下游依次由核基質(zhì)結合區(qū)序列、啟動子、目的基因、終止子和核基質(zhì)結合區(qū)序列組成。

在上述方法中，所述核基質(zhì)結合區(qū)序列來源于煙草（如煙草品種W38）基因組，所述核基質(zhì)結合區(qū)序列具體如序列表中序列1所示。

所述啟動子可為Ubiquitin啟動子。在本發(fā)明的一個實施例中，所述Ubiquitin啟動子來源于載體pAHC25，所述Ubiquitin啟動子的序列具體如序列表中序列2所示。

所述終止子可為NOS終止子。在本發(fā)明的一個實施例中，所述NOS終止子來源于載體pAHC25，所述NOS終止子的序列具體如序列表中序列3所示。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述植物為小麥，具體為小麥（Triticum?aestivum?L.）品種科農(nóng)199或濟麥22。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述目的基因為GUS基因，所述GUS基因來源于載體pAHC25；在本發(fā)明的另一個實施例中，所述目的基因為GmDREB3基因。

更加具體的，所述GmDREB3基因的序列如序列表中序列4所示；所述GUS基因的序列如序列表中序列5所示。

在實際應用中，所述DNA片段是與抗性篩選基因共同導入到所述目的植物中的。

所述抗性篩選基因是以抗性基因表達盒的形式導入所述目的植物中的。

所述抗性基因表達盒自5’端至3’端，依次由啟動所述抗性基因轉錄的啟動子、所述抗性基因，以及終止所述抗性基因轉錄的終止子組成。

在本發(fā)明的一個實施例中，所述抗性基因為Bar基因；啟動所述Bar基因轉錄的啟動子為Ubiquitin啟動子；終止所述Bar基因轉錄的終止子為NOS終止子。

在上述方法中，所述轉化為基因槍轉化。

本發(fā)明所提供的轉化植物的方法在培育轉基因植物中的應用，也屬于本發(fā)明的保護范圍。