[發(fā)明專利]一種銀杏酚酸的生物降解方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210552048.4 | 申請日： | 2012-12-17 |
| 公開（公告）號： | CN103053876A | 公開（公告）日： | 2013-04-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 趙林果;孫偉;曹福亮;姜艷;汪貴斌;鄭璐 | 申請（專利權(quán)）人： | 南京林業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | A23L1/015 | 分類號： | A23L1/015;A23L1/30 |
| 代理公司： | 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200 | 代理人： | 唐循文 |
| 地址： | 210037 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 銀杏 生物降解 方法 | ||
1.一種銀杏酚酸的生物降解方法，其特征在于利用漆酶LacC，降解體系中漆酶LacC的濃度為0.004U/mL-0.006U/mL，降解體系的pH4.0-6.0，降解溫度為45℃～60℃，降解處理時間為10～24小時。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏酚酸的生物降解方法，其特征在于降解體系中添加有終濃度0.1～1mM的2，2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）、1-羥基苯并三唑(HOBT)、紫脲酸(VA)或愈創(chuàng)木酚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述漆酶LacC由下述方法制得：培養(yǎng)栓菌（Trametes?versicolor），培養(yǎng)基為：麩皮20g/L，葡萄糖5g/L，酒石酸銨120mmol/L，200mmol/L?pH?5.0檸檬酸緩沖液，1mmol/L愈創(chuàng)木酚，0.1mL?Tween?80，0.3mmol/LCu2+，培養(yǎng)條件為28℃培養(yǎng)5d；將1L培養(yǎng)好發(fā)酵液置于10000rpm的冷凍離心機(jī)中4℃下離心10min收集上清液即為漆酶粗酶液；然后在上清液中加入終濃度為80%wt的硫酸銨，在4℃下放置24h后置于10000rpm的冷凍離心機(jī)中4℃下離心30min，沉淀用20mM?pH?7.5Tris-HCl?buffer溶解透析；透析處理過的酶液進(jìn)行DEAE?SepharoseTM?CL-6B離子交換柱層析，采用平衡液：20mM?pH?7.5Tris-HCl?buffer，洗脫緩沖液：20mM?pH?7.0Tris-HCl?buffer，NaCl的濃度梯度為0-0.6mol/L，洗脫體積為800mL，洗脫速度：1.5mL/min，每4mL收集一管檢測漆酶活性，通過蛋白檢測儀檢測到三個蛋白峰，最后一個峰所收集的為漆酶LacC。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銀杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述漆酶LacC也可以由下述方法制得：
（1）栓菌（Trametes?versicolor）的培養(yǎng)：培養(yǎng)基為PDA：葡萄糖20g/L，馬鈴薯汁20%wt，接種新鮮的栓菌菌絲，28℃下180rpm培養(yǎng)3-4天過濾收集菌絲體；
（2）栓菌總RNA的提?。喝∈占乃ň木z體用PBS緩沖溶液清洗后，在液氮下研磨菌絲體至粉末狀，收集到2mL離心管中，加入1mL?Trizol后劇烈震蕩，4℃下12000g離心10min后轉(zhuǎn)移上清液至2mL離心管，加入200μL氯仿震蕩15s混勻后30℃下孵育2-3min，4℃下12000g離心10min取上層清夜，加入上清液0.8倍體積的異丙醇混勻后4℃下12000g離心10min，去凈上清后用75%wt乙醇水溶液清洗2次后4℃下7500g離心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入DEPC水溶解RNA沉淀，作為模板RNA，-20℃下保存；
（3）栓菌cDNA的合成：以栓菌總RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈：
在微量離心管中配制下列模板RNA/Primer反應(yīng)液：
50μM?Oligo?dT???????1μL，
10mM?dNTP?Mixture????1μL，
總RNA????????????????1μg，
DEPC-H2O?????????????7μL；
混勻后65℃下保溫5min后冰上放置1min；
在上述微量離心管中配制下列cDNA合成反應(yīng)液：
上述RNA/Primer混合液??????????10μL，
5×PrimeScript?Buffer?????????4μL，
40U/μL?RNase?Inhibiter???????0.5μL，
200U/μL?PrimeScript?RTase????1μL
RNase?free?H2O????????????????4.5μL;
上述反應(yīng)液混勻后在50℃下保溫1h，70℃下保溫15min后冰上冷卻，得到的反應(yīng)液立即用于cDNA第二鏈的合成；
（4）栓菌基因的克隆：設(shè)計LacC引物，載體為pPICZαB：
P9:GGGGAATTCATGGGCAAGTTTCACTCTTTTGTGAA；
P10:GGGTCTAGATCAGAGGTCGGACGAGTCCAAA；
基因LacC的克隆利用引物P9和P10，反應(yīng)條件為94℃，5min；暫停計時，加Ex?Taq聚合酶，加40μL石蠟油密封；30次循環(huán)（94℃，30s；58℃，30s；72℃，90s）；72℃，10min；反應(yīng)停止，4℃保溫；得到基因LacC，用EcoR?I，XbaI酶切，同時表達(dá)載體也用相同的酶分別酶切，基因LacC和酶切后的載體分別連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到重組質(zhì)粒pPICZαB-LacC；
（5）重組漆酶LacC的制備：將重組質(zhì)粒pPICZαB-LacC線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母得到重組菌，將重組酵母菌劃線于YPD平板上進(jìn)行活化，28℃培養(yǎng)2天，至長出單菌落后接種于10mL?BMGY液體培養(yǎng)基中，于30℃，200r/min搖床培養(yǎng)48h，OD600達(dá)2~6，3000rpm離心5min收集菌體，棄上清，用無菌純凈水洗滌菌體1~2次；將菌體用BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基稀釋至OD600=1，用4層紗布代替棉花塞，于28℃，180r/min搖床培養(yǎng)，每天補(bǔ)加甲醇至終濃度為0.6%(V/V)；將培養(yǎng)好的培養(yǎng)基置于10000rpm的冷凍離心機(jī)中4℃下離心10min收集上清液即為漆酶粗酶液；首先超濾裝置對漆酶粗酶液濃縮；然后在濃縮液中加入終濃度為80%wt的硫酸銨，在4℃下放置24h后置于10000rpm的冷凍離心機(jī)中4℃下離心30min，沉淀用20mM?pH?7.0Tris-HCl?buffer溶解透析；透析處理過的酶液進(jìn)行DEAE?SepharoseTM?CL-6B離子交換柱層析，采用平衡液：20mM?pH?7.0Tris-HCl?buffer，洗脫緩沖液：含0.4、0.6、1.0M的20mM?pH?7.0Tris-HCl?buffer，洗脫速度：0.5mL/min，每6min收集一管，檢測漆酶活性，得到重組漆酶LacC。
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