[發明專利]一種乙型肝炎病毒表面抗體的納米磁微粒化學發光測定試劑盒及其制備方法和檢測方法

無效

• 申請號: 201210551567.9
• 申請日: 2012-12-18
• 公開（公告）號: CN103063845A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 于大為;程曉蕾
• 申請（專利權）人: 蘇州浩歐博生物醫藥有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/76;G01N33/531;G01N33/533
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛;汪青

1.一種乙型肝炎病毒表面抗體的納米磁微粒化學發光測定試劑盒，所述試劑盒包括：

第一試劑：含熒光素標記的乙型肝炎病毒表面抗原的溶液；

第二試劑：含堿性磷酸酶標記的乙型肝炎病毒表面抗原的溶液；

磁分離劑：含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。

2.根據權利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗體的納米磁微粒化學發光測定試劑盒，其特征在于：所述堿性磷酸酶標記的乙型肝炎病毒表面抗原由堿性磷酸酶與乙型肝炎病毒表面抗原通過交聯劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯和2-亞氨基硫烷鹽酸鹽連接構成。

3.根據權利要求1或2所述的乙型肝炎病毒表面抗體的納米磁微粒化學發光測定試劑盒，其特征在于：所述第一試劑中的熒光素標記的乙型肝炎病毒表面抗原的濃度為0.5~1μg/mL，所述第一試劑的pH為7-9；所述第二試劑中的堿性磷酸酶標記的乙型肝炎病毒表面抗原的濃度為0.5~1μg/mL，所述第二試劑的pH為7-9。

4.一種如權利要求3所述的乙型肝炎病毒表面抗體的納米磁微粒化學發光測定試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述含有熒光素標記的乙型肝炎病毒表面抗原的溶液、所述含有堿性磷酸酶標記的乙型肝炎病毒表面抗原的溶液以及所述包被有熒光素抗體的磁微粒的懸浮液的步驟，其特征在于：所述含有堿性磷酸酶標記的乙型肝炎病毒表面抗原的溶液的制備過程如下：

①將乙型肝炎病毒表面抗原加入交聯劑2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液中室溫靜置后，再加入甘氨酸溶液，再次室溫靜置，收集活化后的乙型肝炎病毒表面抗原，于2~8℃下保存備用；

②將堿性磷酸酶溶液加入交聯劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液，室溫靜置，收集活化后的堿性磷酸酶，于2~8℃下保存備用；

③將上述步驟①所得活化后的乙型肝炎病毒表面抗原與步驟②所得活化后的堿性磷酸酶混合，靜置反應，使生成堿性磷酸酶標記的乙型肝炎病毒表面抗原，反應結束后，將反應液用Supperdex200凝膠純化柱純化，選擇具有適當pH值的緩沖液調整濃度和pH值即得所述第二試劑；

其中，所述的乙型肝炎病毒表面抗原、所述堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%，且所述堿性磷酸酶的比活性超過1000u/mg。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：步驟①中，取乙型肝炎病毒表面抗原，加入偶聯劑2-IT溶液溶解，室溫靜置10min~30min，加入甘氨酸溶液，室溫靜置2~10min，用G-25凝膠純化柱除鹽，收集活化后的乙型肝炎病毒表面抗原，于2-8℃保存備用。

6.根據權利要求4或5所述的制備方法，其特征在于：步驟②中，取濃度大于等于5mg/mL的堿性磷酸酶溶液，加入4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液，室溫靜置20~40min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后堿性磷酸酶，于2-8℃保存備用。

7.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述第一試劑的制備方法如下：配制含有熒光素的pH為9~10的緩沖液，然后按照熒光素與乙型肝炎病毒表面抗原的分子比為20~200:1的比例，將所述含有熒光素的pH為9~10的緩沖液與乙型肝炎病毒表面抗原的pH為9~10的緩沖液混合，混勻后，室溫靜置反應，然后將反應液通過G-25凝膠柱進行分離，除去游離的熒光素，得到含有熒光素標記的乙型肝炎病毒表面抗原的溶液，接著用具有適當pH值的緩沖液調整濃度和pH，即得第一試劑。

8.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述磁分離劑的制備方法如下：使含有羧基活性基團的磁微粒與熒光素抗體在偶聯劑碳二亞胺的存在下，室溫反應2~18小時，反應結束，磁分離，去上清，用具有適當pH值的緩沖液調整pH和濃度，即得所述的磁分離劑；其中所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為0.5~2μm，每克磁微粒上所帶的羧基活性基團的含量大于等于0.4mmol；所述的熒光素抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，純度大于等于90wt%，稀釋效價大于1:100萬。

9.根據權利要求4或7或8所述的制備方法，其特征在于：所述的具有適當pH值的緩沖液為含有0.5%牛血清白蛋白、pH8.0的TRIS緩沖液。

10.采用權利要求1~3中任一項權利要求所述的試劑盒用于對乙型肝炎病毒表面抗體定量檢測的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）免疫反應：在檢測管中加入待測樣本原液，依次加入第一試劑和第二試劑，混勻，在25~40℃下進行第一次溫育，然后加入磁分離試劑，混勻，在25~40℃下進行第二次溫育；

（2）洗滌：使磁微粒在磁場中沉降，去除上清，加入清洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清；

（3）加底物溶液檢測發光強度：在檢測管中加入堿性磷酸酶催化的化學發光底物，去除磁場，充分混懸后檢測發光強度值。