[發明專利]單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細胞體病的方法

無效

• 申請號: 201210550663.1
• 申請日: 2012-12-18
• 公開（公告）號: CN103869071A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 張述智;夏偉;朱紹輝;張浩;王曉麗;徐權汗;李之詳;許團輝
• 申請（專利權）人: 青島中仁藥業有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細胞體病的方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）標準陽性對照和陰性對照的設立，將自然感染率達90％以上，且經瑞氏、姬姆薩和吖啶橙染色檢測均為陽性的豬血作為標準陽性抗原對照；將來自西藏地區且經壓片、瑞氏、姬姆薩和吖啶橙染色及PCR檢測均為陰性的豬血作為陰性對照；

（2）抗原包被，取標準陽性和陰性血樣涂片，晾干，并設空白對照；

（3）熒光二抗的稀釋，分別用0.01％?的伊文思藍和0.01?mol／L?PBS稀釋FITC標記的山羊抗鼠IgG抗體；

（4）IFA測定，將已包被好的兩組標準陽性和陰性對照的玻片，用冷丙酮和甲醛等比例混合液固定15?min，室溫下干燥，加入相應編號的抗豬附紅細胞體的單克隆抗體20?L，置濕盒中37℃下作用30?min，用PBS輕輕沖洗，然后浸泡于PBS盒中，于電動搖床上輕微搖動，連續洗滌3次，待免疫熒光片干燥后將其中一組標準陽性和陰性抗原及空白對照玻片中加入10?L用0．01％伊文思藍稀釋的熒光抗體；另一組加入10L用0．01mol／LPBS稀釋的熒光抗體，置濕盒中37℃下作用30?min，用PBS輕輕沖洗，然后浸泡于PBS盒中，于電動搖床上輕微搖動，連續洗滌3次，待干燥后滴加甘油-PBS緩沖液，覆加蓋玻片，置熒光顯微鏡下觀察。

2.根據權利要求1所述的單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細胞體病的方法，其特征在于：所述步驟（1）中所用的瑞氏、姬姆薩和吖啶橙染色方法步驟如下：

（1）瑞氏染色，取一潔凈載玻片，以其右端1/3蘸血一滴，作血涂片，自然晾干后滴加瑞氏染液1min，加等量0.01mol/L?PBS(PH6.4)混勻，染色3-5min，水洗，室溫干燥后鏡檢；

（2）姬姆薩染色，作血涂片，自然晾干后用甲醇固定2-3min，加姬姆薩染液15-30min，水洗，室溫干燥后鏡檢；

（3）吖啶橙染色，做血涂片，自然晾干后用95%乙醇固定15-30min，濾紙吸干，1%醋酸作用30s,PBS清洗1min，于0.01%吖啶橙染液中染色1-5min，PBS清洗1min,用0.1mol/L?CaCl2分色0.5-2min,PBS清洗3次，每次數秒，甘油和PBS等比例混合封片，立刻于熒光顯微鏡下觀察。