[發(fā)明專利]基于代謝調(diào)控高產(chǎn)土霉素的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210550528.7
• 申請(qǐng)日: 2012-12-18
• 公開（公告）號(hào): CN103865946A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭美錦;張嗣良;于嵐;王龍;顏湘云;儲(chǔ)炬;莊英萍;肖慈英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/76
• 分類號(hào): C12N15/76;C12N1/21;C12P29/00;C12R1/59
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于鏈霉菌代謝工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種基于代謝調(diào)控高產(chǎn)土霉素的新工藝。

背景技術(shù)

鏈霉菌是抗生素的主要生產(chǎn)菌株，目前很多鏈霉菌的基因組已經(jīng)完成測(cè)序，通過(guò)基因序列的同源性比對(duì)，很多功能基因(調(diào)控因子)被發(fā)現(xiàn)，并在體外和體內(nèi)進(jìn)行了鑒定，很多調(diào)控因子與抗生素合成相關(guān)，通過(guò)調(diào)控抗生素合成途徑中的相關(guān)基因的表達(dá)量，從而提高抗生素的產(chǎn)量。這為進(jìn)一步利用這些調(diào)控因子作為靶點(diǎn)進(jìn)行基因改造，獲得抗生素高產(chǎn)突變菌株提供了便利。

龜裂鏈霉菌(Streptomyces?rimosus)作為工業(yè)用于生產(chǎn)四環(huán)素類抗生素的生產(chǎn)菌株，也是土霉素的主要生產(chǎn)菌株。土霉素(Oxytetracycline，OTC)是一種臨床上廣泛應(yīng)用的廣譜抗生素，由Finlay等人于1950年首次報(bào)道在Streptomycesrimosus中發(fā)現(xiàn)。目前報(bào)道的OTC生產(chǎn)菌還有：Streptomyces?capuensis，Streptomyces?henetus和Streptomyces?platensis等。OTC對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、陰性細(xì)菌，螺旋菌，立克次體以及一些病毒具有抗菌性，通過(guò)可逆地結(jié)合到30S核糖體亞基上，阻止氨酰tRNA核糖體復(fù)合體的形成，從而達(dá)到抑菌的效果。然而，為了提高土霉素的產(chǎn)量，本領(lǐng)域還有必要進(jìn)一步研究提高土霉素產(chǎn)量的方法。

區(qū)別于傳統(tǒng)菌種選育的方法，基因水平操作具有快速、有效獲得定點(diǎn)突變株的優(yōu)勢(shì)。提高基因組中抗生素合成途徑相關(guān)基因的拷貝數(shù)來(lái)提高抗生素的產(chǎn)量的方法盡管已在現(xiàn)有技術(shù)中被應(yīng)用，但提高合成途徑中哪個(gè)或哪些基因的拷貝有作用是不確定的，基因的選擇難度很大。并且很多現(xiàn)有研究顯示，提高基因的拷貝數(shù)不能保證基因的表達(dá)水平隨著拷貝數(shù)的增加而增加，由于菌株本身存在自我調(diào)節(jié)作用，很多情況下即使提高基因拷貝數(shù)也不能改變基因表達(dá)水平，不能進(jìn)一步提高抗生素的合成。提高基因拷貝數(shù)是否有作用還取決于基因本身的特性，很多基因并不能藉由提高拷貝數(shù)來(lái)增加表達(dá)。因此，為了提高土霉素的產(chǎn)量，需要對(duì)土霉素合成途徑中相關(guān)基因進(jìn)行篩選，以定位到關(guān)鍵性的，可有效實(shí)現(xiàn)調(diào)控的基因。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于代謝調(diào)控高產(chǎn)土霉素的新工藝。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種增加龜裂鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量的方法，所述方法包括：在龜裂鏈霉菌基因組中增加1-8個(gè)拷貝(如2、3、4、5、6、7個(gè)拷貝)的rgC基因。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述方法還包括：在龜裂鏈霉菌基因組中增加1-8個(gè)拷貝(如2、3、4、5、6、7個(gè)拷貝)的otrC。

在另一優(yōu)選例中，所述方法包括：

(1)提供表達(dá)載體，所述表達(dá)載體中包含rgC基因的序列；

(2)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化龜裂鏈霉菌，選擇基因組中整合有外源的rgC基因序列的重組龜裂鏈霉菌。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法的步驟(1)中，所述的表達(dá)載體中還包含otrC基因；和(2)中，選擇基因組中整合有外源的rgC基因序列、otrC基因序列的重組龜裂鏈霉菌。

在另一優(yōu)選例中，所述的rgC與otrC基因的序列以串聯(lián)的形式存在。

在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體中，rgC序列的5’端，包括ermEp1啟動(dòng)子。

在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是pSET152載體。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組的龜裂鏈霉菌，其基因組中整合有外源的1-8個(gè)拷貝的rgC基因。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的重組的龜裂鏈霉菌中還含有1-8個(gè)拷貝的外源的1-8個(gè)拷貝的otrC基因。

在另一優(yōu)選例中，所述的重組的龜裂鏈霉菌是通過(guò)前面任一所述的方法制備獲得。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種生產(chǎn)土霉素的方法，所述方法包括：培養(yǎng)前述的重組的龜裂鏈霉菌，從而生產(chǎn)土霉素。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說(shuō)明

圖1、通過(guò)增加龜裂鏈霉菌中rgC基因的拷貝數(shù)來(lái)提高其土霉素產(chǎn)量的流程圖。

圖2、整合質(zhì)粒pSET152的結(jié)構(gòu)，其包含ΦC31整合酶基因序列、噬菌體附著位點(diǎn)attP序列，以及篩選標(biāo)記阿普拉(Aprmycine)抗性基因序列。

圖3、重組質(zhì)粒pSET152-ermEp1-rgC(pSERC)，其中ermEp1為一個(gè)紅霉素強(qiáng)啟動(dòng)子序列，在重組質(zhì)粒中位于rgC基因的上游。