[發(fā)明專利]一種乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒及其制備方法和檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210550172.7
• 申請日: 2012-12-18
• 公開（公告）號: CN103048454A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于大為;程曉蕾
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: G01N33/576
• 分類號: G01N33/576;G01N33/577;G01N33/531;G01N33/533;G01N33/535
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛(wèi);汪青

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)合了免疫磁微粒分離技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒及其制備方法和檢測方法。

背景技術(shù)

乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）是以隱蔽形式存在HBV核心中的一種可溶性蛋白，其編碼基因相互重疊，是HBcAg的亞成分。在感染HBV后，HBeAg可與HBsAg同時或稍后出現(xiàn)于血中，其消失則稍早于HBsAg。HBsAg僅存在于HBsAg陽性者的血液中，通常伴有肝內(nèi)HBV?DNA的復(fù)制，血中存在較多Dane顆粒和HBV?DNA聚合酶活性增高，因此，HBeAg陽性是病毒活動性復(fù)制的重要指標，傳染性高。急性肝炎患者若HBeAg持續(xù)陽性10周以上，則易于轉(zhuǎn)為持續(xù)感染。

目前用于檢測乙型肝炎病毒e抗原的免疫分析方法主要有酶聯(lián)免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。酶聯(lián)免疫分析法存在靈敏度低，線性范圍窄、不易實現(xiàn)全自動化等方法學(xué)限制因素。化學(xué)發(fā)光免疫分析法是在酶聯(lián)免疫分析法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種免疫檢測技術(shù)，具有靈敏度高、檢測線性范圍寬、操作簡便，自動化程度高等優(yōu)勢。目前化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)因其具有上述諸多優(yōu)點得到了廣泛的應(yīng)用。

然而，在實際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含的雜質(zhì)成分較多，一定程度上影響了檢測靈敏度和準確性，所以從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中快速分離、純化出目的待測物，是臨床檢驗工作者面臨的難題之一。

磁微粒免疫檢測技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親和力的抗體或抗原等各種免疫活性物質(zhì)，具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好、操作簡單、不影響被分離細胞或其他生物材料的生物學(xué)性狀和功能等特點，在外加磁場作用下可定向運動，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒，其能夠以較低的成本制備得到，且能夠?qū)崿F(xiàn)乙型肝炎病毒e抗原準確和高精確地定量測定。

本發(fā)明同時還提供一種乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒的制備方法，該方法工藝穩(wěn)定，成本低，且所得試劑盒的精密度高。

癌抗原所用的試劑盒的簡便和低成本的制備方法。

一種乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括：

第一試劑：含熒光素標記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液；

第二試劑：含堿性磷酸酶（ALP）標記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的溶液；

磁分離劑：含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。

優(yōu)選地，該堿性磷酸酶標記的乙型肝炎病毒e抗原抗體由堿性磷酸酶與乙型肝炎病毒e抗原抗體通過交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯（Succinimidyl?4-(N-Maleimidomethyl)Cyclohexane-1-Carbo，SMCC）和2-亞氨基硫烷鹽酸鹽（2-Iminothiolane?HCl，2-IT）連接構(gòu)成。

進一步地，所述磁微粒試劑中，包被有熒光素抗體的磁微粒由熒光素抗體與磁微粒通過偶聯(lián)劑相化學(xué)偶聯(lián)。

進一步地，所述第一試劑中的熒光素標記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的濃度為0.5~1μg/mL，所述第一試劑的pH為7-9；所述第二試劑中的堿性磷酸酶標記的乙型肝炎病毒e抗原抗體的濃度為0.5~1μg/mL，所述第二試劑的pH為7-9。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉，本發(fā)明的試劑盒還可以進一步包括有其它檢測所需的試劑，例如底物溶液。但是諸如底物溶液等其它試劑可以另行購買或配制，因此，雖然試劑盒中可以包括這些試劑，但它們對于本發(fā)明試劑盒來說并非必不可少。

本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是：一種上述的乙型肝炎病毒e抗原的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測定試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述第一試劑、所述第二試劑以及磁分離劑的步驟，其中：所述第二試劑的制備過程如下：

①將乙型肝炎病毒e抗原抗體加入交聯(lián)劑2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液中室溫靜置后，再加入甘氨酸溶液，再次室溫靜置，收集活化后的乙型肝炎病毒e抗原抗體，于2~8℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

②將堿性磷酸酶溶液加入交聯(lián)劑4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液，室溫靜置，收集活化后的堿性磷酸酶，于2~8℃下保存?zhèn)溆茫?/p>