[發(fā)明專利]游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒及其制備和檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210550171.2
• 申請(qǐng)日: 2012-12-18
• 公開（公告）號(hào): CN103048475A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于大為;程曉蕾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州浩歐博生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/76
• 分類號(hào): G01N33/76;G01N21/76
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 孫仿衛(wèi);汪青

1.一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其特征在于，包括如下試劑：

第一試劑：含熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、pH為7.0-9.0的緩沖溶液，所述的熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的濃度為0.5~1μg/mL；

第二試劑：含堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、pH為7.0-9.0的緩沖溶液，所述的堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的濃度為0.5~1μg/mL；

磁分離試劑：含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其特征在于：所述的堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體由堿性磷酸酶與游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體通過交聯(lián)劑琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物和2-亞氨基四氫噻吩連接構(gòu)成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微粒化學(xué)發(fā)光測(cè)定試劑盒，其特征在于：所述的包被著熒光素抗體的磁微粒中，熒光素抗體與磁微粒之間化學(xué)偶聯(lián)。

4.一種如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述的第一試劑、所述的第二試劑以及所述的磁分離試劑的步驟，其特征在于：所述的第二試劑的制備方法如下：

（1）使游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與交聯(lián)劑2-亞氨基四氫噻吩在甘氨酸溶液中，室溫靜置反應(yīng)，生成游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與2-亞氨基四氫噻吩的連接物，于2-8℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）使堿性磷酸酶溶液與交聯(lián)劑琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物溶液混合，室溫靜置反應(yīng)，將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱除鹽，將收集到的堿性磷酸酶與琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物的連接物于2-8℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

（3）將步驟（1）所得溶液與步驟（2）所得溶液按照游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與2-亞氨基四氫噻吩的連接物與堿性磷酸酶與琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧化物的連接物的摩爾比為1:1~2混合，在2-8℃下反應(yīng)，使生成所述的堿性磷酸酶標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液通過Supperdex200凝膠純化柱純化，選擇合適的pH緩沖液調(diào)整濃度和pH值即得所述的第二試劑。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、所述的堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%，且所述堿性磷酸酶的比活性超過1000u/mg，所述堿性磷酸酶的緩沖液的濃度超過5mg/ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述的第一試劑的制備方法如下：配制含有熒光素的pH為9~10的緩沖液，然后按照熒光素與游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的分子比為20~200:1的比例，將所述含有熒光素的pH為9~10的緩沖液與游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體混合，室溫靜置反應(yīng)，將反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去游離的熒光素，獲得熒光素標(biāo)記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的溶液，接著用具有適當(dāng)?shù)膒H值的緩沖液調(diào)整濃度和pH，即得所述第一試劑。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述的磁分離試劑的制備方法如下：使含有羧基活性基團(tuán)的磁微粒與熒光素抗體在偶聯(lián)劑的存在下，室溫反應(yīng)2~12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，磁分離，去上清，用具有適當(dāng)pH值的緩沖液調(diào)整pH和濃度，即得所述磁分離試劑。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于：所述的磁微粒具有超順磁性，其直徑為0.5~2微米，每克磁微粒上所帶的羧基活性基團(tuán)的含量不低于0.4mmol；所述的熒光素抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，純度大于等于90wt%，稀釋效價(jià)大于1:100萬；所述的偶聯(lián)劑為碳二亞胺。