[發(fā)明專利]一種引物中部序列干擾PCR技術(shù)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210550086.6
• 申請(qǐng)日: 2012-12-17
• 公開（公告）號(hào): CN103114131B
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江洪;岳素文;廖同兵;江必勝;曲越;江雨康
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 珠海市坤元農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686
• 代理公司: 北京海虹嘉誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 吳泳歷

1.一種引物中部序列綜合干擾PCR方法, 其特征在于：于PCR引物緩釋條件下進(jìn)行靶基因PCR擴(kuò)增，PCR系統(tǒng)具有以下（a）、（b）和（c）特征，可以在不影響靶基因與引物全長(zhǎng)序列的結(jié)合及特異性擴(kuò)增效率的情況下選擇性地抑制引物間末端結(jié)合及引物二聚體PD非特異性擴(kuò)增：

（a）包括上、下游引物，所述上、下游引物的中部序列堿基不互補(bǔ); 所述中部序列堿基不互補(bǔ)指中部序列5'-3'方向平行比對(duì)，偏3'端位置即離3'末端4-5個(gè)堿基起倒數(shù)5-9個(gè)堿基堿基連續(xù)不互補(bǔ),引物對(duì)3'端之間避免2個(gè)以上反向互補(bǔ)堿基,引物3'最末端1～2堿基避免之間任何單個(gè)反向互補(bǔ)堿基，其末端以堿基C或A結(jié)尾；

（b）所述上、下游引物，還包括與一條所述引物中部序列互補(bǔ)的反義堿基寡核苷酸；所述反義堿基寡核苷酸片段，具有5-11個(gè)末端封閉的化學(xué)修飾反義修飾堿基，其既不能充作PCR模板也不能作為引物,保留了結(jié)合功能，能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合引物中部序列干擾引物間聚合, 僅引物中部序列的所述反義堿基寡核苷酸干擾不影響引物與靶基因特異性結(jié)合及特異性擴(kuò)增效率, 而選擇性地抑制優(yōu)化引物PCR引物二聚體PD非特異性擴(kuò)增；

（c）所述上、下游引物，采用與引物中部序列互補(bǔ)的反義堿基序列連接于引物5'端前面形成引物分子內(nèi)3'端含特異性靶結(jié)合序列和5'端含反義堿基序列的嵌合引物；所述與引物中部序列互補(bǔ)的反義堿基序列指上游引物和／或下游引物中部序列區(qū)5-7堿基序列的反義鏈堿基以5'-3'方向以化學(xué)合成方式加在對(duì)應(yīng)的所述上游或下游引物的5'端從而形成嵌合引物，5'端反義堿基序列能反折并與引物自身中部序列結(jié)合抑制，能顯著減少體系內(nèi)引物二聚體PD非特異性擴(kuò)增反應(yīng)，

所述方法為非診斷目的。

2.一種引物中部序列綜合干擾PCR方法, 其特征在于：于PCR引物緩釋條件下進(jìn)行靶基因PCR擴(kuò)增，PCR系統(tǒng)具有以下（a）和（b）特征，可以在不影響靶基因與引物全長(zhǎng)序列的結(jié)合及特異性擴(kuò)增效率的情況下選擇性地抑制引物間末端結(jié)合及引物二聚體PD非特異性擴(kuò)增：

（a）包括上、下游引物，所述上、下游引物的中部序列堿基不互補(bǔ); 所述中部序列堿基不互補(bǔ)指中部序列5'-3'方向平行比對(duì)，偏3'端位置即離3'末端4-5個(gè)堿基起倒數(shù)5-9個(gè)堿基連續(xù)不互補(bǔ),引物對(duì)3'端之間避免2個(gè)以上反向互補(bǔ)堿基,引物3'最末端1-堿基避免之間任何單個(gè)反向互補(bǔ)堿基，其末端以堿基C或A結(jié)尾；

（b）所述上、下游引物，還包括與一條所述引物中部序列互補(bǔ)的反義堿基寡核苷酸；所述反義堿基寡核苷酸片段，具有5-11個(gè)末端封閉的化學(xué)修飾反義修飾堿基，其既不能充作PCR模板也不能作為引物,保留了結(jié)合功能，能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合引物中部序列干擾引物間聚合, 僅引物中部序列的所述反義堿基寡核苷酸干擾不影響引物與靶基因特異性結(jié)合及特異性擴(kuò)增效率, 而選擇性地抑制優(yōu)化引物PCR引物二聚體PD非特異性擴(kuò)增，

所述方法為非診斷目的。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物中部序列綜合干擾PCR方法，其特征在于，所述PCR系統(tǒng)還采用單鏈結(jié)合蛋白SSB，聯(lián)用顯著增強(qiáng)用于聯(lián)合SSB抑制PCR非特異性作用。

4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的干擾PCR方法， 所述的引物中部序列不互補(bǔ)指相同方向比對(duì)6-8堿基不互補(bǔ),其能選擇性地干擾引物間聚合的非特異性擴(kuò)增, 其中部同向不互補(bǔ)堿基數(shù)不夠6堿基時(shí)在不互補(bǔ)序列5'側(cè)人為突變一個(gè)堿基以增加一個(gè)不配對(duì)堿基, 或不互補(bǔ)序列中間差一個(gè)時(shí)突變成不配對(duì)/同序；如不互補(bǔ)序列5'側(cè)突變不夠好就再選擇其3'側(cè)臨近堿基突變；中部序列不互補(bǔ)區(qū)引入一個(gè)RNA堿基/2-F RNA修飾堿基來(lái)增加引物間負(fù)電荷斥力而輕度提升抑制PD非特異性；且所述上、下游引物對(duì)3'末端倒數(shù)第二、三個(gè)堿基避免為CG/GC序列，以避免部份抵消中間序列不互補(bǔ)區(qū)域的抑制PD作用。