[發明專利]在重組畢赤酵母中高效表達抗菌肽NZ2114的方法

有效

• 申請號: 201210550063.5
• 申請日: 2012-12-17
• 公開（公告）號: CN103045636A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 王建華;張勇;滕達;王秀敏;毛若雨
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

1.一種含有編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列的表達載體，其特征在于，包括誘導型啟動子、位于啟動子下游的編碼α-因子分泌信號肽的核苷酸序列以及編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列，所述編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表達產物切割識別序列AAGAGA。

2.根據權利要求1所述的表達載體，其特征在于，所述編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列如SEQ?ID?No.2所示。

3.根據權利要求1所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體的出發載體為pPICZαA。

4.根據權利要求1所述的表達載體，其特征在于，在編碼α-因子分泌信號肽的核苷酸序列的5’端連接有XhoI酶切位點，且在XhoI酶切位點的5’端連接有保護堿基CCG；在編碼抗菌肽NZ2114的DNA序列的3’端連接有XhaI酶切位點，且在XhaI酶切位點的3’端連接有保護堿基GC。

5.含有權利要求1-4任一項所述表達載體的宿主細胞。

6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其為畢赤酵母。

7.根據權利要求6所述的宿主細胞，其為畢赤酵母X-33基因工程菌。

8.權利要求7所述基因工程菌的培養方法，包括以下步驟：

1）種子液的制備：從YPD平板挑取酵母轉化子單菌落，接種于含100μg/ml?zeocin的10ml?YPD液體培養基中，29℃，250rmp，搖床培養18-24h，以1%接種量接種于200ml?YPD液體培養基中，29℃，250rmp，搖床培養16-18h，至OD_600nm值為6，即得種子液；

2）發酵培養：25℃~29℃下，按10%的接種量將上述種子液加入2L基礎鹽培養基中，調pH值至5.0，加入9.6ml?PMT1，通氣量維持在8vvm，轉速為600rpm，溶氧維持在20%以上；

3）飼喂碳源：觀測溶氧值開始緩慢下降后突然上升至80%以上，開始流加含12‰PMT1的50%葡萄糖溶液，流加速度為12~24ml/L/min，連續流加6~8h，轉速上調至1000rpm；

4）甲醇誘導：流加葡萄糖后，饑餓半小時，開始補加100%甲醇，由第一小時的流速1ml/L/min逐漸增加到第六小時的6ml/L/min，轉速上調至1100rpm，pH上調至5.5，控制溶氧在20%以上，至發酵結束；

其中，步驟2）中使用的基礎鹽培養基配方為：45g葡萄糖、50gNH₄H₂PO₄、20g?K₂SO₄、15g?MgSO₄7H₂O、6g?KH₂PO₄、0.4g?CaSO₄和1.5g?KOH，加水定容至1L。

9.一種在重組畢赤酵母中表達抗菌肽NZ2114的方法，其是利用權利要求1-4任一項所述的表達載體轉化畢赤酵母，獲得的重組畢赤酵母經過發酵培養，分泌產生抗菌肽NZ2114。

10.重組畢赤酵母菌（Pichia?pastoris）X-33/NZ2114，其保藏編號為CGMCC?No.6987。