[發(fā)明專利]一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF及其用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210549926.7
• 申請(qǐng)日: 2012-12-17
• 公開（公告）號(hào): CN103045608A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 房婭博;蔣科技;張鳳英;馬凌波;宋煒;馬春艷;胡敬環(huán)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/16
• 分類號(hào): C12N15/16;C07K14/575;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及甲殼類免疫器官中表達(dá)的基因序列，具體涉及一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的基因序列及其用途。

背景技術(shù)

甲殼類動(dòng)物免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩種方式。細(xì)胞免疫包括吞噬作用、包圍化及結(jié)節(jié)的形成；體液免疫系統(tǒng)包括粉氧化酶原激活系統(tǒng)、各種凝集素及抗菌肽等。

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子最早是在1966年研究遲發(fā)型超敏反應(yīng)的時(shí)候發(fā)現(xiàn)的一種分子，它具有多種生物活性，既是一種細(xì)胞因子，又是一種源于垂體的激素，還可以作為糖皮質(zhì)激素生理活動(dòng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑。在脊椎動(dòng)物體免疫體統(tǒng)方面，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)、刺激T細(xì)胞增殖，并在自身免疫系統(tǒng)疾病中參與作用。另外，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

擬穴青蟹是四種青蟹之一，屬節(jié)肢動(dòng)物門，甲殼綱，十足目，爬行亞綱，短尾派，梭子蟹科。具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和工業(yè)價(jià)值，是我國(guó)三大經(jīng)濟(jì)蟹類之一。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，在養(yǎng)殖過程中，由于水質(zhì)、苗種質(zhì)量以及細(xì)菌感染等原因容易導(dǎo)致青蟹的大量死亡。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的基因序列及其用途。該基因的獲得不僅為研究甲殼類巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子在免疫反應(yīng)中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的蛋白產(chǎn)物，為進(jìn)一步研究MIF的免疫功能提供理論基礎(chǔ)；該基因還可以用于擬穴青蟹的抗病相關(guān)研究。

本發(fā)明提供了從擬穴青蟹肝胰腺SMART?cDNA文庫(kù)中篩選出的一個(gè)巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的核苷酸序列、氨基酸序列及其時(shí)空表達(dá)圖譜以及在擬穴青蟹抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案：

一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF，具有如SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。

一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF，它所編碼的蛋白質(zhì)具有如SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列。

本發(fā)明所述的擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF是從擬穴青蟹肝胰腺的SMARTcDNA質(zhì)粒文庫(kù)中篩選到的一個(gè)基因。該基因cDNA長(zhǎng)734bp，自99bp到461bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼120個(gè)氨基酸。

擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF的cDNA序列如SEQ?ID?No.1所示。

擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發(fā)明還提供一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF?ORF的核苷酸克隆方法，其中，所涉及的引物序列如下：

上游引物：5’-CCGAAGAACCTCACTCCA-3’，

下游引物：5’-CAGCCGACAATCGAAATAT-3’。

本發(fā)明還提供一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)方法，其中，所述的檢測(cè)方法為使用一對(duì)熒光定量PCR引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，所述的一對(duì)熒光定量PCR引物由上游引物和下游引物組成，其中，所述的引物如下：

上游引物：5’-CGAACCTGCCCAAGGAGAA-3’，

下游引物：5’-ACTGGTGCCGCCGAAAG-3’。

本發(fā)明還提供了上述的一種擬穴青蟹巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子基因MIF在制備擬穴青蟹抵抗病原微生物入侵產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中，所述的病原微生物為副溶血性弧菌。

本發(fā)明利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了MIF在擬穴青蟹的血細(xì)胞、肝胰腺、心臟、精巢、心臟、鰓中的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明：該基因在所檢測(cè)的六個(gè)組織中均有mRNA存在，其中在肝胰腺中的豐度最高，其次在血細(xì)胞和鰓中。另外還檢測(cè)到經(jīng)副溶血性弧菌刺激后的血細(xì)胞中的MIF基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，明顯較正常水平高，這顯示該基因在擬穴青蟹抵抗病原微生物入侵中具有重要功能。

有益效果

本發(fā)明的基因的獲得不僅為研究甲殼類巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子在免疫反應(yīng)中的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，而且通過基因序列可以獲得具有生物活性的蛋白產(chǎn)物，為進(jìn)一步研究MIF的免疫功能提供理論基礎(chǔ)。此外，本發(fā)明的基因還可以用于擬穴青蟹的抗病相關(guān)研究。

附圖說明

圖1是采用TaKaRa?rTaq擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2是熒光定量檢測(cè)MIF在擬穴青蟹六個(gè)組織中的表達(dá)情況；