[發明專利]一種改良的工業規模制造DNA的方法

有效

• 申請號: 201210549891.7
• 申請日: 2012-12-18
• 公開（公告）號: CN103865919A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 邱蔚然;周潔;邱志云;祁妤琳
• 申請（專利權）人: 南通秋之友生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海金盛協力知識產權代理有限公司 31242
• 代理人: 羅大忱

技術領域：

本發明涉及一種制造高純度DNA的方法。

背景技術：

小牛胸腺、魚類精子和植物種子的胚等含有豐富的DNA，是提取DNA的良好材料。從培養微生物著手，然后從微生物中提取DNA亦有報道，但尚未用于工業生產。故而，從小牛胸腺，或魚類精子（魚白）提取DNA的方法是目前工業規模制造DNA的主要方法。

一般制備方法是首先將新鮮（或冰凍）小牛胸腺或魚白先去除血水和結締組織，在冰浴上切成小塊，加緩沖液洗滌后用組織搗碎機（8000轉/分-12000轉/分）搗碎，用含0.14mol/L氯化鈉的檸檬酸緩沖液，洗滌多次，去除核糖核蛋白，然后獲得脫氧核糖核蛋白（或細胞核）。在工業制備時至少投料100KG或更多原料，故將只有幾十克小牛胸腺或魚白的血水、結締組織去除干凈是很困難的，特別是原料從外地，外單位采購時，一般都是冰凍的，里面夾雜雜質是必然的。另外組織搗碎機只能在實驗室使用，這些都是工業生產難關。本發明根據動物細胞特別是小牛胸腺、魚類精子等動物細胞因為沒有細胞壁，而且細胞較易破碎的特點。采用絞肉機破碎細胞，然后用緩沖液洗滌離心，很容易將脫氧核糖核蛋白或細胞核提取出來，血水可通過緩沖液洗滌時去除、結締組織用10-80目尼龍網或鋼絲網過濾便可留存在網上而去除。這樣可克服原料處理不好而帶來的影響。

在去蛋白時，由于考慮到成本和安全，工業生產一般不采用苯酚法提取DNA。大都采用SDS等去污劑使蛋白變性的方法。但此辦法，由于工業生產規模大，不可能非常嚴格地在低溫操作或保證DNA絕對不降解，工業制備DNA分子量相對要小一些。故而按照以前方法，在加入乙醇后，往往DNA沉淀不下來，而且得率和純度很低。

DNA制備方法很多，但大都是實驗室技術。例如文獻（1）《生化實驗方法和技術》（第二版，高等教育出版社）介紹的方法。即利用動物組織的脫氧核糖核蛋白可溶于水或鹽溶液（如1mol/L氯化鈉），但在0.14mol/L鹽溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白則溶于0.14mol/L鹽溶液中，利用這一性質可將脫氧核糖核蛋白與核糖核蛋白以及其他雜質分開。分離得到脫氧核糖核蛋白后，再進一步將蛋白質等雜質除去。

經常采用的去除蛋白方法有三種：（1）用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使乳化，然后離心除去變性蛋白質，此時蛋白質凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積95%乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來。如果用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀，得到的是游離DNA。（2）用十二烷基硫酸鈉（SDS）等去污劑使蛋白質變性，可以直接從生物材料中提取DNA。（3）苯酚法：用苯酚處理，然后離心分層，DNA或溶于上層水相中，或存在于中間殘留物中，蛋白質變性后停留在酚層內。由于苯酚能使蛋白質迅速變性，因而抑制了核酸酶活性，并且操作過程比較緩和，可以得到較好的DNA制品，所以實驗室除去蛋白的方法一般都采用苯酚法。

在采集小牛胸腺和魚類精子原料時，小牛胸腺往往會有較多結締組織、血水等雜質，而魚類精子較為干凈，雜質較少。故而國內外大都采用魚類精子提取DNA，一般國外產品可達85-90%含量，而國內一般只有70%左右。而用小牛胸腺制備因難度較高，故而未見產品供應。

發明內容：

本發明的目的是提供一種改良的工業規模制造高純度DNA的方法，以克服現有技術存在的缺陷。

本發明的方法，包括如下步驟：

將十二烷基硫酸鈉SDS解離后的DNA溶液，加入1-2mol/L?NaOH，調節pH至堿性，優選的，pH為8.5～12.0，特別優選的為10.0、11.0，靜置1-2小時，離心收集清液，加入1-2mol/L?HCL，將清液調pH至7.0～7.5，優選7.0，再加入等量95%酒精沉淀，收集沉淀，洗滌干燥，即可獲得所述的產品DNA，含量(W/W)可達91%。

所述DNA溶液的制備方法為常規的，如文獻：“生化實驗方法和技術”，（第二版，高等教育出版社）介紹的方法；

所述DNA來源于小牛胸腺、魚類精子（或魚白）；

術語“加入等量95%酒精”，指的是pH7.0-7.5清液與95%酒精體積之比；

優選的，在制備脫氧核糖核蛋白時，考慮到沉淀量較多，工業生產時，可采用碟片式離心機；

而第二次去蛋白時沉淀量較少，離心時可采用高速管式離心機，這樣可以獲得較好效果，縮短操作時間，并提高收率。