[發(fā)明專利]家畜精原干細(xì)胞培養(yǎng)液

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210549380.5
• 申請(qǐng)日: 2012-12-07
• 公開（公告）號(hào): CN103074297A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳應(yīng)積;羅奮華;張巖;薩初拉;蘇慧敏;劉陶迪;于泊洋;劉林洪;包佳婧;孔群芳;劉代艷;劉燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/076
• 分類號(hào): C12N5/076
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種家畜精原干細(xì)胞培養(yǎng)液。?

背景技術(shù)

精原干細(xì)胞(SSCs)是最重要的成體干細(xì)胞之一。精原干細(xì)胞不僅有傳宗接代的遺傳功能，近來(lái)研究顯示，精原干細(xì)胞很容易通過(guò)退分化產(chǎn)生多能干細(xì)胞。這使得精原干細(xì)胞操作技術(shù)得到生命科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)和醫(yī)學(xué)各路專家的垂青【1】。自從精原干細(xì)胞移植技術(shù)【2，3】建立以來(lái)，精原干細(xì)胞的研究得到了空前的發(fā)展。近年來(lái)又建立了小鼠和大鼠精原干細(xì)胞的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)方法【4，5】。若要在體外對(duì)精原干細(xì)胞進(jìn)行操作，那么首先就要對(duì)精原干細(xì)胞進(jìn)行分離和純化培養(yǎng)。在小鼠睪丸內(nèi)的全部生殖細(xì)胞中，僅有0.03％是干細(xì)胞【6】，因此對(duì)精原干細(xì)胞進(jìn)行分離和純化是培養(yǎng)精原干細(xì)胞關(guān)鍵的一步。國(guó)內(nèi)精原干細(xì)胞的研究近幾年取得了較大的進(jìn)展。上海交通大學(xué)吳際團(tuán)隊(duì)在小鼠精原干細(xì)胞的自我更生、增殖培養(yǎng)、冷凍儲(chǔ)存及睪丸移植等方面的研究取得了好成果【7，8】。?

精原干細(xì)胞不僅在生殖生物學(xué)研究中具有重要價(jià)值，也是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)研究的新的方向【9】。制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法有多種。當(dāng)前常用的制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法有兩種：DNA原核顯微注射法和核移植法。這兩種方法的共同點(diǎn)是，都進(jìn)行胚胎操作；不同點(diǎn)是，外源基因的重組整合時(shí)間點(diǎn)不同。原核顯微注射法外源基因的重組整合在胚胎顯微操作之后，外源DNA只能隨機(jī)整合，無(wú)選擇余地，因而產(chǎn)生嵌合體的比例高，產(chǎn)生生殖系遺傳的比例低，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平在不同個(gè)體中差異大。最大的弱點(diǎn)是成功率低。因此家畜轉(zhuǎn)基因操作已經(jīng)不用DNA原核顯微注射法。核移植法轉(zhuǎn)基因，也稱轉(zhuǎn)基因克隆，外源基因的重組整合發(fā)生在胚胎顯微操作之前，先篩選基因重組體細(xì)胞做為供體再進(jìn)行?核移植，因而保證產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有生殖系遺傳特性。但是，核移植法也有它的弱點(diǎn)，除了效率低之外，還常伴有出生體重超常和生理不正常等。核移植過(guò)程不能避免表觀遺傳改變的影響，也使轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物對(duì)外源基因的表達(dá)存在不確定性。用精原干細(xì)胞移植法制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，既可以先篩選基因重組的精原干細(xì)胞，又不會(huì)受表觀遺傳改變的影響。因?yàn)榫杉?xì)胞在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中具有卓越的穩(wěn)定性和增殖潛能，它們有一個(gè)獨(dú)特的機(jī)制，能防止已損壞的遺傳基因和表觀遺傳性狀傳播給后代。這些特性使精原干細(xì)胞成為具有吸引力的目標(biāo)生殖系的遺傳修飾【10】。這些研究結(jié)果說(shuō)明用精原干細(xì)胞移植法制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有內(nèi)在的優(yōu)點(diǎn)。?

精原干細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存是雄性動(dòng)物種質(zhì)資源保存研究的新的分支。至今為止哺乳動(dòng)物種質(zhì)資源都是用卵母細(xì)胞冷凍保存。一旦精原干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)方法和冷凍儲(chǔ)存方法都建立起來(lái)了，雄性動(dòng)物的種質(zhì)資源就有保存方法了，而且比卵母細(xì)胞的保存簡(jiǎn)便，復(fù)蘇后又可以增殖擴(kuò)大培養(yǎng)。如小鼠精原干細(xì)胞經(jīng)過(guò)2年多的培養(yǎng)，超過(guò)(增殖超過(guò)10(85)倍)，將其移植到先天性不孕的受體小鼠的生精小管，仍能使其恢復(fù)生育力，并產(chǎn)生有正常生育力的后代【11】。這些特性將使精原干細(xì)胞成為有潛力的種質(zhì)資源。?

通過(guò)退分化誘導(dǎo)精原干細(xì)胞能夠產(chǎn)生多能干細(xì)胞，用于組織器官康復(fù)臨床醫(yī)療的研究及應(yīng)用【12，13，14】。精原干細(xì)胞及其衍生的多能干細(xì)胞在再生醫(yī)療方面將有大的作為。也許在不久的將來(lái)，男士們就可以通過(guò)自己睪丸的一個(gè)小小的切片來(lái)治愈自身的疾病【15】。?

可見精原干細(xì)胞在生殖生物學(xué)研究、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)研究、退分化誘導(dǎo)產(chǎn)生多能干細(xì)胞研究、動(dòng)物種質(zhì)資源保存研究及組織器官康復(fù)臨床醫(yī)療研究上具有重要意義。精原干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立，對(duì)多個(gè)學(xué)科的研究和應(yīng)用有促進(jìn)作用。但是，家畜精原干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)至今仍然是世界難題。精原干細(xì)胞研究最著名的專家Brinster帶領(lǐng)的研究組2008年曾經(jīng)發(fā)表論文說(shuō)過(guò)大動(dòng)物精原干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)方法的建立還需要5至10年的研究【16】。雖然鼠類的精原干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)方法已經(jīng)建立，種族差別、基因庫(kù)差別、市售抗體不能通用等多種因素的存在，家畜精原干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)方法不能照搬鼠類的方法。鑒于家畜精原干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)技術(shù)意義重大，不僅具有理論價(jià)值，在農(nóng)牧業(yè)和醫(yī)?學(xué)上還具有經(jīng)濟(jì)應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)價(jià)值【1】，美、歐、日、澳、韓等國(guó)均有科研組織致力于家畜精原干細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的研究，曾有家畜精原干細(xì)胞的純化、鑒定方面的報(bào)道，但是家畜精原干細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)還沒(méi)有成功。國(guó)內(nèi)西北農(nóng)林科技大學(xué)張涌團(tuán)隊(duì)在牛精原干細(xì)胞分離純化方面取得了一定的成果【17】。但是，至今還沒(méi)有看到完整的家畜精原干細(xì)胞長(zhǎng)期純化培養(yǎng)方法、分子水平特異鑒定及遺傳修飾的報(bào)道。?