[發明專利]乳酸乳球菌N8 Nisin免疫耐受相關基因irpT及應用

無效

• 申請號: 201210549064.8
• 申請日: 2012-12-17
• 公開（公告）號: CN102943079A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 喬明強;趙凱;朱多龍;張續;馮舟;軒轅錚錚;白艷玲;徐海津;張秀明
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N1/20;C12R1/46
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術領域

本發明屬于微生物生物技術領域，特別涉及一種乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相關基因，即irpT基因。?

背景技術

乳鏈菌肽Nisin高效、安全、無毒，是國際公認的最為安全的生物防腐劑，廣泛應用于食品和醫藥行業，對于提高食品安全性、防治細菌性疾病有著重要作用。Nisin可以抑制絕大多數革蘭氏陽性菌，主要通過抑制細胞壁合成，即形成穿膜孔道、引起胞內小分子物質外泄、誘導細菌自溶酶釋放或抑制孢子形成四種方式。為避免對自身菌體的破壞，由Nisin基因簇編碼的NisI和NisFEG四個蛋白協同作用，為產Nisin的乳酸乳球菌提供了免疫保護。但近幾年的研究表明，不產Nisin的乳酸乳球菌也可以被誘導產生對Nisin的耐受性，說明Nisin的免疫耐受系統是一個復雜的調控網絡。?

因此，在Nisin基因簇中的基因，乳酸乳球菌中還有很多基因參與免疫耐受性的調控。有許多基因共同參與，這些基因的功能有的是已知的，有些還有待研究，對Nisin免疫耐受性相關基因的研究有助于了解Nisin免疫耐受性的網絡調控機制，通過對Nisin耐受相關新基因的深入研究，可以進一步解釋Nisin耐受的網絡調控機制，為構建Nisin基因工程菌、提高Nisin工業產量、降低生產成本提供理論指導，有著重要的理論和現實意義。?

發明內容

本發明目的是提供與乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相關的基因，即irpT基因，為構建Nisin高產的基因工程菌提供理論依據。?

本發明提供的乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相關的基因irpT基因，具有如序列表所示核苷酸序列，其基因長度為708bp。?

上述的提供的乳酸乳球菌Nisin免疫耐受相關的irpT基因，可以進一步解釋Nisin耐受的網絡調控機制，并且為構建Nisin高產的基因工程菌提供理論依據。?

本發明基因的獲得方法：使用人工Mu轉座技術（一種基于噬菌體Mu轉座子的轉座技術），造成乳酸乳球菌N8基因突變，建立突變子文庫。篩選Nisin耐受增強的突變子，使用限制性內切酶PvuⅡ對基因組DNA,酶切，酶切片段與pUC18載體連接，通過電轉化將連接產物導入大腸桿菌DH5α，用氨芐青霉素LB平板篩選陽性轉化子，測定轉化子中插入片段的核苷酸序列，發現Mu插入的基因，確定此基因與Nisin免疫耐受有相關性。?

本發明的優點和有益效果：?

實驗發現本發明基因的失活能夠增強乳酸乳球菌對Nisin的免疫耐受性。?

Mu插入失活基因使細菌對Nisin的免疫耐受性顯著增強，說明此基因與乳酸乳球菌Nisin的免疫耐受性相關，這可以進一步解釋Nisin耐受的網絡調控機制，并且為構建Nisin高產的基因工程菌提供理論依據。?

通過本發明，可以針對irpT基因設計突變及敲除方法，限制其正常表達，使得乳酸乳球菌對Nisin的免疫耐受性顯著增強，利于工業上的高效發酵生產。?

附圖說明

圖1是乳酸乳球菌N8和乳酸如球菌irpT::Mu?N8?Nisin?MIC（IU/ml）檢測。?

圖2是Mu轉座子PCR產物電泳圖(用PCR方法檢測轉化子的Mu轉座子)；?

泳道1為負對照，模板為乳酸乳球菌N8基因；?

泳道2為正對照，模板為Mu轉座子DNA的質粒pLEB620；?

泳道M為DNAmarker；?

泳道4-6為隨機挑選的乳酸乳球菌N8突變株。?

用EeyMu1和EeyMu2作為引物，可以擴增出730bp的特異性片段，確認Mu轉座復合物DNA片段的存在。?

圖3是乳酸乳球菌N8irpT::Mu?N8基因組單點插入Southern雜交檢測；?

泳道1為PvuII酶解的乳酸乳球菌N8基因組；?

泳道2為紅霉素Mu轉座子片段；?

泳道3為PvuII酶解的乳酸乳球菌N8?irpT::Mu?N8基因組；?

泳道4為EcoRI酶解的乳酸乳球菌N8?irpT::Mu?N8基因組。?

具體實施方式

實施例1：使用Mu轉座技術進行突變子文庫的建立?

(1)Mu轉座復合物的制備:?