[發明專利]用于豬流感病毒實時熒光定量PCR檢測的引物集

有效

• 申請號: 201210548547.6
• 申請日: 2012-12-17
• 公開（公告）號: CN103014176B
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 孟珊珊;王丹娜;杜金玲;王吉瑋;石磊;王貴華;趙亞榮
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司動物醫學研究中心;北京大北農科技集團股份有限公司;北京科牧豐生物制藥有限公司;福州大北農生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及H1和H3亞型豬流感病毒的核苷酸片段擴增引物，用于豬流感病毒的Real-time PCR檢測及分型，屬于生物技術領域。

背景技術

豬流感（Swine Influenza，SI）是由豬流感病毒（Swine influenzavirus，SIV）引起的一種急性、傳染性的豬呼吸道疾病，該病的主要病征為突發、咳嗽、呼吸困難、發熱、衰竭，還可導致懷孕母豬繁殖障礙。SIV屬正粘病毒科A型流感病毒屬，囊膜上有放射狀排列的突起糖蛋白，分別為血凝素（Hemagglutinin，HA）、神精氨酸酶(Neuraminidase，NA)和M2蛋白（Matrix 2protein）。根據病毒血凝素（Hemagglutinins,HA）和神經氨酸酶（Neuraminidase,NA）抗原性的差異，可將A型流感病毒分為16種不同的HA亞型（H1~H16）和10種NA亞型（N1~N9）。

由于豬體內既存在α2,6唾液酸受體，又存在α2,3唾液酸受體，因而可被人源、禽源及豬源的流感病毒同時感染，是導致新型流感毒株產生的重要中間宿主，被稱為“基因混合器”，而流感病毒又具有抗原漂移和重組特性，從而大大增加了豬體內產生新型流感病毒的幾率，成為公共衛生的重大隱患。從1918年的西班牙大流感到2009年H1N1流感的全球性大爆發，流感一直危害著全人類。除此之外，豬流感還可常常引發豬群并發或繼發其他病毒或細菌的感染，給畜牧業造成巨大的經濟損失。因而，豬流感病毒的監控顯得尤為重要。SIV的亞型達11種之多，古典豬H1N1和類人H3N2亞型為目前在豬群中廣泛流行的主要亞型。因此針對這兩種亞型SIV建立快速、靈敏的檢測方法，對于監測SIV的流行和亞型分布是非常必要的。

目前豬流感病毒的檢測方法主要包括：（1）血清學檢測：主要有酶聯免疫吸附實驗（ELISA）、微量血凝抑制實驗（HI）等，這些方法需要高免單因子血清，對實驗材料要求較高，且操作步驟較為繁瑣；（2）核酸檢測：主要有RT-PCR、全基因組測序及芯片檢測等。RT-PCR檢測方法靈敏度高，特異性好，需要的時間短。全基因組測序和芯片檢測可獲得信息量大，但是花費高，費時長，不適用于豬流感病毒的早期快速檢測。

Real-time PCR（實時熒光定量PCR）是在普通PCR技術基礎上發展起來的一種新型PCR技術，通過熒光染料對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算獲得待測樣品模板的初始濃度。根據實驗材料不同，可分為TaqMan探針法和SYBR Green I染料法。TaqMan探針法中的引物包括一對寡核酸引物和一條熒光標記的特異性探針，熒光標記的探針設計及合成都較普通引物要繁瑣，且價格較普通引物高。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一組用于豬流感病毒SYBGREEN I Real-time PCR（實時熒光定量PCR）檢測法的引物集，包括豬流感病毒通用型M基因、H1亞型、N1亞型、H3亞型和N2亞型引物。引物序列見表1。

表1 SIV Real-time PCR引物表

本發明提供的引物適用于SYBGREEN I Real-time PCR，可對豬源鼻拭子、豬氣管、豬肺臟及豬肺臟灌洗液中的豬流感病毒進行快速監測及亞型分析。

本發明提供的引物集可與常規的Real-time PCR試劑組裝成試劑盒，因此，本發明還提供含有所述引物集的豬流感病毒SYBGREEN IReal-time PCR檢測試劑盒。

本發明提供了一組用于豬流感病毒檢測及分型的Real-time PCR引物，該引物適用于SYBR Green I染料法，以降低SIV的檢測成本，并實現對SIV的快速分型檢測，為臨床監測SIV疫情動態和流行趨勢提供技術支撐。

本發明提供的引物靈敏度與已知的用于TaqMan探針法的引物靈敏度相當，但引物的合成成本較TaqMan探針法低。

本發明提供的豬流感病毒亞型鑒定引物特異性好，與其它禽流感病毒和普通季節性流感無交叉反應。

將本發明提供的引物用于檢測疑似感染豬流感病毒的豬肺臟組織，結果表明SIV通用型M基因引物與SIV分型引物所獲得檢測結果一致，可將該引物用于豬流感病毒的臨床檢測及分型鑒定。

附圖說明