[發明專利]一種適用于煙堿及其代謝物分離的毛細管電色譜測定方法

有效

• 申請號: 201210548355.5
• 申請日: 2012-12-18
• 公開（公告）號: CN102967675A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 劉紹鋒;劉惠民;謝復煒;張曉兵
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/60
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

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技術領域

本發明屬于分析化學領域，具體涉及一種適用于煙堿及其代謝物分離的毛細管電色譜測定方法。

背景技術

吸煙引起的危害是當今世界最嚴重的公共衛生問題之一。如何深入研究煙堿在體內的代謝情況，發展高效、高選擇性的分離手段，分離煙堿代謝物（降煙堿、降可替寧、3-羥基可替寧、N-氧化可替寧、N-氧化煙堿、可替寧糖苷），對于客觀反應煙氣感受量是很有必要。

目前，煙堿及其代謝產物含量的測定主要采用放射免疫法、氣相色譜或氣相色譜-質譜聯用技術、高效液相色譜或高效液相色譜-質譜聯用技術等方法。放射免疫法需要使用兩種放射性同位素¹²⁵I和³H，方法特異、靈敏且易于操作，但放射免疫法不僅需要煙堿的抗體，還需要煙堿各種代謝物的抗體，而制備抗血清是個技術瓶頸。色譜法技術特異性好且靈敏度高，可以同時測定體液中的煙堿和可替寧等，與放射免疫法相比，色譜法不易受其它因素的影響。由于氣質聯用儀器只能監控煙堿和可替寧等少數代謝物,?且質譜儀的成本昂貴，不利于推廣；高效液相色譜法洗脫時間較長，且使用大量對人體有毒有害的有機溶劑，并易對環境造成污染。因此，創新發展高效、高選擇性分離手段和靈敏的檢測模式，已成為測定煙堿及其結構相似的代謝物，準確判定人體實際煙氣感受量的關鍵問題。

毛細管電色譜(CEC)技術作為新興分析技術，為提高分離效率和分離選擇性提供了極好的契機。在CEC?中，煙堿化合物在適當的條件下帶有正電荷，帶電荷的煙堿物質在CEC?中的輸運不僅在固定相和流動相間分配，而且受到電滲流驅動作用,在分離綜合了CE?和HPLC?的分離機制,電泳遷移對整體輸運過程的貢獻也占有非常重要的地位。毛細管電色譜柱作為一種柱內原位聚合或填充的固定相，毛細管電色譜整體柱基質表面性質多樣化、多孔性能優越，柱容量高，具有分離快速、高效、高容量的特點，是應復雜生物樣品高通量分析需要而發展起來的一種新型色譜微分離手段。

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發明內容

本發明的目的正是基于上述現有技術狀況而提供的一種適用于煙堿及其代謝物分離的毛細管電色譜測定方法。

本發明的研究機理在于：針對堿性煙堿及其代謝物在硅膠基團上的不可逆吸附問題，將功能化的整體柱引入CEC分離模式，在毛細管柱中修飾內鹽兩性表面活性劑、或引入有機無機雜化多面體倍半硅氧烷、或對常規無機硅膠進行端基動態修飾，抑制極性煙堿的吸附作用，在功能化毛細管硅膠柱的基礎上，發展一種用于煙堿及其代謝物分離的毛細管電色譜方法。本發明所述的毛細管硅膠功能柱由三甲銨乙內酯修飾的雜化硅膠毛細管柱、端基封尾的十八烷基硅烷鍵合硅膠毛細管柱或多面體倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羥乙酯聚合柱中的一種組成，通過在毛細管柱末端施加負電荷高壓和進樣端上施加液相泵輔助壓力，實現電泳分離和毛細管液相色譜分離的雙重作用，實現煙堿及其代謝物（包括煙堿、降煙堿、N-氧化煙堿、去甲基可替寧、3-羥基可替寧、可替寧、可替寧-葡（萄）糖苷、N-氧化可替寧）的連續分離。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種適用于煙堿及其代謝物分離的毛細管電色譜測定方法，包括毛細管電色譜分離測定中使用的毛細管硅膠功能柱，其中：毛細管硅膠功能柱為經過處理的特定毛細管硅膠功能柱，所述特定毛細管硅膠功能柱由三甲銨乙內酯修飾的雜化硅膠毛細管柱、端基封尾的十八烷基硅烷鍵合硅膠毛細管柱或多面體倍半硅氧烷甲基丙烯酸-甲基丙烯酸羥乙酯共聚聚合柱中的任意一種組成；同時在毛細管硅膠功能柱末端施加負電荷高壓和進樣端上施加液相泵輔助壓力，在電泳分離和毛細管液相色譜分離的雙重作用下實現煙堿及其代謝物的分離。

所述煙堿及其代謝物化合物包括煙堿、降煙堿、N-氧化煙堿、去甲基可替寧、3-羥基可替寧、可替寧、可替寧-葡（萄）糖苷、N-氧化可替寧。

本發明將功能化的整體柱引入CEC分離模式，篩選適合于煙堿及其代謝產物分離的分離柱，針對堿性煙堿在硅膠基團上的不可逆吸附問題，在毛細管柱中修飾內鹽兩性表面活性劑、或引入有機無機雜化多面體倍半硅氧烷、或對常規無機硅膠進行端基動態修飾，抑制極性煙堿的吸附作用，同時，強化整體柱電滲流，加快分離速度。該技術綜合應用了電泳和色譜模式分離待測物，快速、高效。