[發明專利]一種運用激流式生物反應器生產豬細小病毒滅活疫苗的方法

有效

• 申請號: 201210545873.1
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN102988972A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 徐明明;陳申秒;董新榮
• 申請（專利權）人: 山東濱州沃華生物工程有限公司
• 主分類號: A61K39/23
• 分類號: A61K39/23;A61K9/107;A61P31/20;C12N7/00;C12N7/06
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 張建成

1.一種運用激流式生物反應器生產豬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于生產方法及步驟如下：

（1）豬細小病毒種毒的制備：將從液氮中復蘇的IBRS-2細胞轉瓶傳代，待細胞長成單層時，棄去培養液，將豬細小病毒接種到IBRS-2細胞，接種劑量為0.01MOI，接種后換2%血清的維持液培養，待IBRS-2細胞病變達80%以上時收獲病毒液，將收獲的病毒液進行病毒滴度測定和無菌檢驗，病毒液的TCID₅₀≥?10^6.5TCID₅₀/ml，無菌檢測合格作為豬細小病毒種毒；

（2）IBRS-2細胞接種激流式生物反應器：先將轉管培養的IBRS-2細胞用胰蛋白酶進行消化，當消化下來的細胞液總體積為4升，細胞個數達到約2×10⁹時，將細胞液用蠕動泵打入激流式反應器的紙片載體中，進行細胞的繁殖培養，培養細胞時激流式生物反應器的溫度設定為37℃，pH設定為7.2～7.4，溶氧設定為30~60%；

（3）生物反應器細胞接種豬細小病毒：當激流式生物反應器中細胞密度達到1×10⁷個細胞/ml時，將制備的豬細小病毒種毒接種到激流式生物反應器中培養的IBRS-2細胞，接種劑量為0.01MOI，接種后靜置吸附1h，病毒培養時激流式生物反應器設定溫度為36.5℃，pH設定為7.4～7.6，溶氧設定為30~60%，振蕩器轉速55rpm/min；

（4）接毒60h后，收獲繁殖的病毒液，滅活，配苗即得到豬細小病毒滅活疫苗。

2.根據專利要求1所述的一種運用激流式生物反應器生產豬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于：步驟（3）中向生物反應器接種病毒前，應先將生物反應器中培養液全部排空，用預熱的無菌PBS循環沖洗細胞2遍，排空PBS，再用蠕動泵將預熱的種毒打入灌注袋中，接種后向生物反應器的激流袋內打入培養基。

3.根據專利要求1所述的一種運用激流式生物反應器生產豬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于：步驟（4）中所述的病毒液的收獲包括細胞上清液和含有紙片載體的灌注袋中的病毒液，病毒液中病毒含量每毫升不低于10^8.0TCID₅₀，病毒液對豚鼠紅細胞血凝效價不低于1:512的可用。

4.根據專利要求1所述的一種運用激流式生物反應器生產豬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于：步驟（4）中所述的滅活是用甲醛滅活，向病毒液中加40%的甲醛溶液，邊加邊混合，至混合液中甲醛溶液終濃度為0.3%時，停止加入，然后將病毒滅活液置于37℃溫室中放置48h，期間振搖3～4次，然后將病毒滅活液置于2～8℃保存。

5.根據專利要求1所述的一種運用激流式生物反應器生產豬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于：步驟（4）中所述的配苗是將含白油的油相和含病毒液的水相乳化均勻，步驟為將油相打入乳化罐中，開動混合機至2000r/min低速轉動攪拌，同時徐徐加入水相，加完后提轉速至2900r/min乳化30～100min，乳化后，取10ml左右以3000r/min離心15分鐘，若有分層現象，應重復乳化一次。

6.根據專利要求5所述的一種運用激流式生物反應器生產豬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于：所述的油相是將注射用白油94重量份，硬脂酸鋁0.5重量份混合，然后再加6重量份的司班-80，在121℃下高壓滅菌30min制成。

7.根據專利要求5所述的一種運用激流式生物反應器生產豬細小病毒滅活疫苗的方法，其特征在于：所述的水相是將保存不超過1個月的病毒液96重量份，?0.01重量份的疊氮鈉和0.015重量份的氧氟沙星混合晃勻，然后加入4重量份20～30℃的吐溫－80，充分振搖至完全溶解制成。