[發(fā)明專利]一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增懸浮干細(xì)胞的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210545385.0
• 申請(qǐng)日: 2012-12-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103045539A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 殷勤偉;黃兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黃兵
• 主分類號(hào): C12N5/095
• 分類號(hào): C12N5/095
• 代理公司: 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11411
• 代理人: 鄭自群

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增懸浮干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

腫瘤是威脅人類健康的一種重要疾病，是目前人類疾病死亡的第二殺手。白血病是人體循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤，近年來(lái)該疾病的發(fā)生呈顯著的增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，并呈現(xiàn)低齡化的趨勢(shì)。人們對(duì)白血病的治療，主要通過(guò)化療的方法。雖然骨髓抑制被認(rèn)為是治療白血病和淋巴瘤的有效手段，但是由于血液配型等異體抑制排斥作用的存在，嚴(yán)重限制了骨髓移植技術(shù)的廣泛應(yīng)用。化療技術(shù)雖然能夠顯著抑制白血病和淋巴瘤的增殖，能夠徹底治愈的仍不普遍。大約50年前，人們最早從髓性白血病的發(fā)生和演變規(guī)律中提出了腫瘤干細(xì)胞的概念，并認(rèn)為這些腫瘤干細(xì)胞是正常干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞通過(guò)突變形成的。正常造血干細(xì)胞能夠持續(xù)分化成造血細(xì)胞，如紅細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞（包括T-淋巴細(xì)胞和B-淋巴細(xì)胞）、中性粒性細(xì)胞等。腫瘤干細(xì)胞與正常干細(xì)胞具有相似的性質(zhì)，也能分化、增殖成具有基因缺陷的造血細(xì)胞系或未成熟的祖細(xì)胞，又稱胚細(xì)胞。人們發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與惡化過(guò)程中的作用首先是從急性髓性白血病病人樣品中分離出一種具有表面抗原CD96陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞亞型2，這種腫瘤干細(xì)胞在腫瘤中的數(shù)目極少，但腫瘤的惡性很強(qiáng)，是腫瘤的化療耐藥的重要原因之一，也是白血病化療失敗的重要根源。因此，尋找新的、高效低毒、對(duì)腫瘤干細(xì)胞專一的新的腫瘤治療方法和新的藥物篩選模型是徹底治愈腫瘤疾患的一個(gè)主要技術(shù)瓶徑。

目前從臨床血液樣品，骨髓或白血病細(xì)胞系分離懸浮腫瘤干細(xì)胞仍然是一件非常困難的事，主要原因是由于血液腫瘤干細(xì)胞的數(shù)目非常少。已經(jīng)被廣泛采用的分離方法有兩種，（1）通過(guò)標(biāo)記腫瘤干細(xì)胞的特征表面抗原，采用流式細(xì)胞分選技術(shù)或免疫磁珠分選出富含腫瘤干細(xì)胞的組分。目前所使用的表面特征抗原主要有CD9,CD33,CD44,CD90,CD96,CD110,CD123等。由于采用單一表面抗原對(duì)腫瘤干細(xì)胞的區(qū)分能力具有局限性，用該法分選出的腫瘤干細(xì)胞數(shù)量少，分離過(guò)程中細(xì)胞受損傷以及干細(xì)胞的純度不夠高，是限制深入研究腫瘤干細(xì)胞的一個(gè)技術(shù)屏障。（2）研究腫瘤干細(xì)胞的另一種分選策略是通過(guò)細(xì)胞流式分選技術(shù)將血液腫瘤中的能排出熒光染料，如熒光染料Hoechst?33342,的細(xì)胞，稱為側(cè)群細(xì)胞。由于側(cè)群細(xì)胞只是相對(duì)富集了腫瘤干細(xì)胞，通過(guò)研究腫瘤側(cè)群細(xì)胞的性質(zhì)并不能全面反映腫瘤干細(xì)胞的性質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增懸浮干細(xì)胞的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中腫瘤干細(xì)胞無(wú)法高效低毒的實(shí)現(xiàn)富集和無(wú)分化擴(kuò)增的問(wèn)題。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增懸浮干細(xì)胞的方法，在血液腫瘤細(xì)胞的集落培養(yǎng)中，向胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入Delta-like?4，Jagged?1和FGF2成分因子為培養(yǎng)基主要組分，并向所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入抑制GSK信號(hào)通路抑制劑和酪氨酸激酶抑制劑，進(jìn)行半固體培養(yǎng)，血液腫瘤干細(xì)胞可以形成集落。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述抑制GSK信號(hào)通路抑制劑和酪氨酸激酶抑制劑為CHIR99021、PD173074、PD184352或PD0325901，提高血液腫瘤干細(xì)胞篩選的效率，避免使用昂貴的流式細(xì)胞儀的分選和富集，從而降低懸浮干細(xì)胞的富集成本。

作為優(yōu)選的技術(shù)方法，向所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中添加占所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基體積30-100%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM或RPMI?1640。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述擴(kuò)增懸浮干細(xì)胞的培養(yǎng)基按體積比包括30-100%的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和0-70%的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基HEScGRO。

作為對(duì)上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述擴(kuò)增懸浮干細(xì)胞的培養(yǎng)基還含有0-2μg/ml的DII4、0-1μg/ml的FGF2、0-2μg/ml的Jag1、0-1μg/ml的SCF、0-1μg/ml的LIF、0-1μg/ml的TGF-β、0-1μg/ml的TPO、0-300nM的CHIR99021、0-1μM的PD173074、0-1μM的PD184352和0-1μM的PD0325901。

由于采用了上述技術(shù)方案，一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增懸浮干細(xì)胞的方法，在血液腫瘤干細(xì)胞的集落培養(yǎng)中，向胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入Delta-like?4，Jagged?1和FGF2成分因子為培養(yǎng)基主要組分，并向所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入抑制GSK信號(hào)通路抑制劑和酪氨酸激酶抑制劑，進(jìn)行半固體培養(yǎng)，血液腫瘤干細(xì)胞可以形成集落，解決了現(xiàn)有技術(shù)中腫瘤干細(xì)胞無(wú)法高效低毒的實(shí)現(xiàn)富集和無(wú)分化擴(kuò)增的問(wèn)題。