[發明專利]一種具有穿膜功能的hMnSOD-R9及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201210544100.1
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN103045551A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 王峰;張自德;黃璐圓;吳秋紅;張光;李秀英
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;A61K8/66;A61K38/44;A23L1/305;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

1.一種具有穿膜功能的hMnSOD-R9，其特征在于：所述的hMnSOD-R9的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的hMnSOD-R9，其特征在于：編碼所述的hMnSOD-R9的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

3.用于制備權利要求1所述的hMnSOD-R9的質粒pET15b-hMnSOD-R9，其特征在于：所述的質粒pET15b-hMnSOD-R9由SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列與pET15b質粒構建而成。

4.用于制備權利要求1所述的hMnSOD-R9的菌株Rosetta-gami/pET15b-hMnSOD-R9，其特征在于：所述的菌株Rosetta-gami/pET15b-hMnSOD-R9通過將權利要求3所述的質粒pET15b-hMnSOD-R9轉化Rosetta-gami得到。

5.權利要求1所述的hMnSOD-R9的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）權利要求4所述的菌株Rosetta-gami/pET15b-hMnSOD-R9作為表達菌株，基于大腸桿菌系統進行誘導表達；

（2）收集菌體，用裂解液重懸重懸菌體，冰浴中超聲破碎至溶液澄清，收集上清，用Ni-NTA樹脂純化得到hMnSOD-R9。

6.根據權利要求5所述的hMnSOD-R9的制備方法，其特征在于：

步驟（1）中所述的誘導表達為：挑取Rosetta-gami/pET15b-hMnSOD-R9單菌落接種于5mL含200mg/mL氨芐青霉素的LB培養基于37℃、220rpm培養過夜；按1:100的比例取2mL培養過夜菌液接種到200mL含200mg/mL?AMP的LB培養基37℃、220rpm培養至菌液OD₆₀₀為0.5左右時，加入終濃度為0.5mM的IPTG，于30℃、220rpm誘導培養5h。

7.根據權利要求5所述的hMnSOD-R9的制備方法，其特征在于：

步驟（2）中所述的收集菌體的條件為4℃、5000rpm離心15min收集；收集上清的條件為4℃、13000rpm離心15min收集；

步驟（2）中所述的裂解液為：50mM?NaH₂PO₄，pH?8.0，300mM?NaCl，10mM咪唑；Ni-NTA樹脂純化所用洗滌緩沖液為：50mM?NaH₂PO₄，pH?8.0，300mM?NaCI，20mM咪唑，洗脫緩沖液為：50mM?NaH₂PO₄，pH?8.0，300mM?NaCI，250mM咪唑。

8.根據權利要求5所述的hMnSOD-R9的制備方法，其特征在于：所述的具有穿膜功能的hMnSOD-R9的制備方法還包括將步驟（2）得到的hMnSOD-R9用PBS透析。

9.根據權利要求8所述的hMnSOD-R9的制備方法，其特征在于：所述的透析條件為：用10mM?pH?7.4的PBS作為透析液，把目的蛋白裝入透析袋里透析，室溫下每8h更換一次PBS，更換3次。

10.權利要求1所述的hMnSOD-R9在化妝品、保健品及藥品中的應用。