[發(fā)明專利]一種制備α1-抗胰蛋白酶的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210544015.5
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN102993298A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設計）人: 蔡駿;李澤林;劉波;初毅波;鄧紅;吳強
• 申請（專利權）人: 成都蓉生藥業(yè)有限責任公司
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18
• 代理公司: 成都高遠知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;全學榮

技術領域

本發(fā)明涉及運用改良K-N法組份Ⅳ沉淀制備人α1-抗胰蛋白酶的方法，屬血漿蛋白領域。

背景技術

α1-抗胰蛋白酶(Alpha-1antitrypsin?AAT)。分子由394個氨基酸組成,分子量為52000的糖蛋白,以天然有活性及變性無活性兩種形式存在,由肝臟產(chǎn)生,主要功能為抑制胰蛋白酶和中性白細胞的彈性蛋白酶的活性,還可抑制糜蛋白酶,纖維蛋白溶酶等，為人體內(nèi)功能最強大的酶抑制劑之一。AAT先天性缺乏如基因突變或后天因素如長期吸煙或細菌感染會造成AAT活性中心失活，都會導致AAT功能性不足進而造成機體蛋白酶與抗蛋白酶系統(tǒng)失衡,肺組織抵抗彈性蛋白酶的能力下降,引起肺泡變形及末端小支氣管以及下肺空間擴張等肺組織的慢性損害,會發(fā)生泡性肺氣腫，慢性阻塞性肺病（COPD），成人呼吸道窘迫癥（ARDS），現(xiàn)階段美國FDA批準的臨床適應癥為α1-抗胰蛋白酶遺傳性缺乏引起的肺氣腫，臨床上一直就存在著采用AAT制劑進行增補治療的需求。由于α1-抗胰蛋白酶自身具備抗炎，抗感染以及抗自身免疫反應等多功能特性，故在炎癥性腸病（Inflammatory?bowel?disease?IBD），脂膜炎，脈管炎，鼻竇炎，風濕性關節(jié)炎，糖尿病1型，糖尿病所引起足病，囊性纖維化（粘滯癥），支氣管擴張，肌纖維痛，某些皮膚病像牛皮癬等常見慢性疾病具備潛在治療價值。

國外公司在進行擴大適應癥方面的嘗試并取得了進展，擴大的適應癥為支氣管擴張（Bronchiectasis）和囊性纖維化疾病(Cystic?fibrosis)，糖尿病1型。另有國外公司采用基因重組技術基于釀酒酵母系統(tǒng)表達的重組α－1抗胰蛋白酶rAAT,劑型為膠體，進行了特應性皮膚病的臨床試驗。rAAT也在進行針對其它皮膚炎癥，例如銀屑病以及中耳炎的臨床前研究。至今國內(nèi)沒有商品供應臨床治療需要。開發(fā)AAT能有利于寶貴的血漿資源的綜合利用，極大地提升血漿蛋白生產(chǎn)的附加利潤。因此開展AAT的研發(fā)不僅有很好的經(jīng)濟效益而且會有極佳的社會效益。

國內(nèi)外文獻及專利報道α1-抗胰蛋白酶劑提純原料常為Cohn法組分Ⅳ-1。科恩等Coan?et?al：Preparation?and?Properties?of?Alpha?1-ProteinaseInhibitor?Concentrate?from?Human?Plasma?Vox?Sang.48:333-342(1985)發(fā)表的采用Cohn法組分Ⅳ-1為原料，兩步PEG沉淀，第一步為11.5%為去除雜蛋白，第二步28%為富集沉淀α1-抗胰蛋白酶，再經(jīng)一步DEAE-Sepharose?CL-6B層析，巴氏法病毒滅活，該制劑含有12%白蛋白，2.5%IgA,具備生物活性即抑制豬彈性蛋白酶（PPE活性）的AAT僅占總蛋白含量的60%，基于此工藝，美國Bayer公司開發(fā)出全世界第一個α1-抗胰蛋白酶產(chǎn)品海因等Hein?et?al：Production?of?Alpha?1-Proteinase?inhibitor(Human)Eur.RespirJ.9:16s-20s(1990)發(fā)表的工藝采用Cohn法組分Ⅳ-1為原料，采用PEG沉淀和陰離子交換層析，最終產(chǎn)品的純度為60%。朱威等：α1-抗胰蛋白酶制劑的制備及其病毒滅活，中國生物制品雜志，2001，14（2）：97-101發(fā)表了Cohn法組分Ⅳ抽提液經(jīng)兩次沉淀，第一次去雜，第二次富集α1-抗胰蛋白酶及離子交換批量吸附及凝膠過濾純化α1-抗胰蛋白酶，工藝中僅采用一次病毒滅活，采用的是巴氏法。有改為兩步病毒滅活措施的必要，并且工藝中有PEG4000用量大的缺陷。萊賓等Lebing?et?al：美國專利No.6,462,180:采用CoanⅣ-1為原料，經(jīng)PEG沉淀，再經(jīng)兩步離子交換層析。病毒滅活方法采用去污劑（Tween20）,納米過濾，凍干后干熱病毒滅活，此發(fā)明中病毒滅活工藝較為繁復，可以進一步優(yōu)化。卜鳳榮等：專利申請?zhí)枺?00610103642.X，發(fā)明名稱：α1-抗胰蛋白酶的制備方法，公開了采用組分Ⅳ-1為原料，提取α1-抗胰蛋白酶，病毒滅活方法為S/D病毒滅活和巴氏消毒法的組合，但制備采用PEG沉淀加一步陰離子交換層析，純度還達不到高純的標準。