[發明專利]一種耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶及其表達基因和應用

有效

• 申請號: 201210540712.3
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN103045565A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 裴建軍;龐倩;趙林果;王飛
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N15/66;C12N1/21;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

技術領域

本發明屬于基因工程技術及生物質利用領域，具體涉及對耐高糖β-葡萄糖苷酶和纖維素結合結構域融合及其基因的重組表達與應用。

背景技術

隨著人們生產和生活水平的提高，能源、資源和環境問題日益受到關注，利用農林廢棄物制備生物能源、通過生物技術改善農林產品的品質、提高產品的附加值成為科學家關注的熱點，也是發展綠色經濟的希望所在。β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21）又稱β-D-葡萄糖苷水解酶、龍膽二糖酶、纖維二糖酶、苦杏仁苷酶，是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵的酶（Science,2006,311:484-489.），因而被廣泛應用纖維素水解領域。

纖維素作為植物光合作用的主要多糖類物質，是地球上最為豐富的可再生資源，這在石化能源日漸枯竭的今天是一個亟待開發的天然寶庫。在纖維素水解過程中，β-葡萄糖苷酶的主要作用是降解纖維二糖生成葡萄糖，從而解除酶解體系中纖維二糖對內切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)和外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91)活性的抑制，從而提高酶解效率并降低成本(Biotechnology?Advances,2000,18:355-383.)。目前使用的商業化纖維素酶主要來源于木霉（Trichoderma?sp.），其具有高活力的內切和外切葡聚糖酶，但β-葡萄糖苷酶的活力很低，因此為了解決纖維二糖的抑制作用和提高酶解效率，在降解過程中需加入外源的β-葡萄糖苷酶。目前主要添加黑曲霉（Aspergillus?niger）來源的β-葡萄糖苷酶（Novozymes?SP188），該酶主要是由水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶組成，對纖維二糖具有較高的降解速率，但其耐葡萄糖系數Ki僅為3.4mM（纖維二糖為底物），因而隨體系中葡萄糖濃度的升高，其降解纖維二糖的活力將受到極大的抑制，從而影響纖維素的連續酶解速率和效果(Biotechnology?for?Biofuels,2012,5:31.)。另外，木霉來源的內切和外切葡聚糖酶具有很好的纖維素結合結構域，在纖維素連續降解過程中，大部分內切和外切葡聚糖酶能和沒降解的纖維素結合在一起，通過過濾可以實現內切和外切葡聚糖酶的回收，因而可以直接使用在下一次的纖維素降解。但目前使用的β-葡萄糖苷酶沒有纖維素結合結構域，與纖維素結合能力很弱，因此主要存在于液體中，在連續酶解過程中需再次添加β-葡萄糖苷酶，增加了成本。因此，得到具有纖維素結合能力、耐高濃度葡萄糖、能有效降解纖維二糖的β-葡萄糖苷酶成為了纖維素低成本降解的關鍵。

本實驗室在前期的研究中發現一個來源于Thermoanaerobacterium?thermosaccharolyticum?DSM571的耐高糖β-葡萄糖苷酶，其具有優異的耐葡萄糖系數（Ki為600mM）和纖維二糖降解能力，并對其進行了克隆、表達研究(Biotechnology?forBiofuels,2012,5:31.)。但是關于該β-葡萄糖苷酶與纖維素結合結構域的融合還沒有文獻報道。

發明內容

解決的技術問題：針對現有纖維素水解系統中β-葡萄糖苷酶在應用中的缺點，本發明的目的是獲得一種耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶及其表達基因和應用。

技術方案：

一種耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

表達上述耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶的基因，其DNA序列如SEQ?ID?NO.2所示。

包含上述核苷酸序列的重組質粒。

包含上述核苷酸序列的重組質粒pET-BGL-CBD。

包含耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶基因的重組質粒制備方法，步驟為：

（1）以Thermoanaerobacterium?thermosaccharolyticum?DSM571的基因組為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增，得到耐高糖β-葡萄糖苷酶基因的PCR擴增產物，所述引物為：

P1：CCCCATATGTCGGACTTTAACAAGGAC，下劃線表示Nde?I位點；

P2：CCCGGATCCAATGGTCCTAGTGGAAATAAG，下劃線表示BamH?I位點，并去除終止密碼子；