[發明專利]拮抗抑制血管內皮細胞生長因子與其受體結合的單克隆抗體及分泌它的雜交瘤細胞系與用途

有效

• 申請號: 201210540692.X
• 申請日: 2012-12-14
• 公開（公告）號: CN103865878A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 胡紅群;羅師平;孫亞男;宋曉琦;蔡明文;徐一清;周群敏
• 申請（專利權）人: 蘇州思坦維生物技術有限責任公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/22;G01N33/68;A61K39/395;A61P35/00;C12R1/91
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

1.一種分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，該雜交瘤細胞系的保藏編號為CGMCCNo.5889。

2.一種拮抗抑制血管內皮細胞生長因子與其受體結合的單克隆抗體，由權利要求1所述的雜交瘤細胞系分泌產生。

3.一種如權利要求2所述單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：

步驟1、制備重組人VEGF蛋白為免疫原，具體為：PCR擴增得到編碼人VEGF的基因片斷，將其克隆到酵母表達載體中，獲得表達質粒，轉化酵母菌，篩選出高效表達工程菌株，工程菌株經發酵、誘導表達、分離純化后，獲得純度達95％以上的VEGF蛋白；

步驟2、動物免疫：通過反復多次小劑量的小鼠皮下免疫，獲得分泌高效價的抗人VEGF多克隆抗體；

步驟3、從中挑取小鼠，取其脾臟細胞，通過體外與小鼠骨髓瘤細胞融合；

步驟4、酶聯免疫吸附試驗篩選抗體分泌陽性的雜交瘤細胞；

步驟5、陽性雜交瘤細胞經亞克隆鑒定得到多株穩定分泌抗人VEGF抗體的雜交瘤單克隆細胞；經再次亞克隆鑒定，篩選得到一株如權利要求1所述的雜交瘤細胞；

步驟6、將該雜交瘤細胞擴增培養，收集培養液，采用親合層析法分離純化抗人VEGF單克隆抗體。

4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟2所述小鼠皮下免疫的方法為：將所述純化的重組VEGF蛋白與弗氏完全佐劑混合，于皮下多點注射小鼠。

5.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟6所述的親合層析法具體為：將含單克隆抗體的雜交瘤細胞擴增后，接種于無血清的1640培養基中，37℃培養5天，隨后上清過濾液后上樣至含Protein?G-Sepharose?Fast?Flow親合層析；親合層析柱經以PBS洗脫去除雜蛋白后,再以pH為2.7的甘氨酸液洗脫被吸附的抗體蛋白；洗脫液以1mol/L?Tris(pH9.0)調節pH至7.0，再對10倍的體積的1x?PBS透析12～16后，透析后的樣品再經0.45μm濾膜過濾后即獲得純化的抗人VEGF單克隆抗體。

6.權利要求2所述的抗體在檢測VEGF蛋白的應用。

7.權利要求2所述的抗體在制備治療與血管增生有關疾病的藥物制劑中的應用。

8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述與血管增生有關疾病包括橫紋肌移植瘤、乳腺腫瘤。