[發明專利]布魯氏菌脂多糖共同抗原單克隆抗體的制備及c-ELISA方法的建立

無效

• 申請號: 201210539331.3
• 申請日: 2012-12-13
• 公開（公告）號: CN103864928A
• 公開（公告）日: 2014-06-18
• 發明（設計）人: 步志高;胡森
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 吳小明

技術領域

本發明涉及免疫學領域。具體地，本發明涉及一種針對布魯氏菌(Brucella)脂多糖共同抗原的單克隆抗體，以及基于該單克隆抗體的c-ELISA方法、包含該單克隆抗體的試劑盒和診斷檢測試劑。

背景技術

布魯氏菌病是由布魯氏菌引發的人畜共患傳染病。導致流產、不育和關節炎等癥狀。人感染布魯氏菌產生更為嚴重的癥狀，呈波浪熱，關節和肌肉疼痛難忍，喪失勞動能力，同時還會影響生育，嚴重者可導致死亡。它流行于160多個國家和地區，我國布病疫情在20世紀80年代末至90年代初曾得到較好控制，從1993年后我國布病疫情呈逐年上升趨勢。世界每年因此病都造成巨大的經濟損失。

感染布魯氏菌后產生的血清學反應直接針對于表面的光滑型脂多糖(sLPS)。所以，在人類及動物的布氏桿菌病的診斷中，主要依據對抗S-LPS抗體的檢測。傳統上的程序，根據血清學上的診斷來決定屠殺感染的動物，但是，世界動物衛生組織(OIE)以及我們國家的標準診斷方法中虎紅凝集(RBPT)、試管凝集(SAT)和補體結合實驗(CFT)等都存在問題，如不適合大量的臨床樣品檢測、有假陽性和敏感性不足的問題。

S型布魯氏菌目前發現有四種類型表位：A或者M表位；S型布魯氏菌特有的C表位；S型布魯氏菌與小腸結腸炎耶爾森氏菌O：9共有的C/Y表位。C表位的化學結構目前仍沒有被明確的鑒定。

發明內容

為了解決畜牧業生產中牛羊布病檢測、篩查和檢疫凈化的生產實際需要，同時盡量排除其他有交叉反應細菌的非特異性干擾，本發明人建立了以單克隆抗體14F4為競爭抗體的競爭ELISA檢測方法。該方法適用于大規模臨床樣品的檢測，具有快速、高通量、高敏感性及高特異性的特點，有效地克服了布魯氏病檢測國標的不足。

本研究將3個不同種布魯氏菌的sLPS進行了提取、純化和鑒定，并研制了針對S型布魯氏菌O鏈C抗原表位的特異性單克隆抗體，建立了cELISA診斷方法，為布病檢測、篩查和檢疫凈化的生產實際需要，提供了新的檢測手段，使布病的檢測結果更加準確可靠。

更具體地，本發明提供以下各項：

1.針對光滑型布魯氏菌(Brucella)脂多糖(sLPS)的單克隆抗體。

2.根據以上1所述的單克隆抗體，其中所述布魯氏菌是布魯氏菌疫苗株M5-90。

3.根據以上1或2所述的單克隆抗體，其針對S型布魯氏菌特有的C表位，優選所述單克隆抗體的重鏈亞型為IgG3，輕鏈均為κ鏈。

4.根據以上1-3中任一項所述的單克隆抗體，其由小鼠雜交瘤細胞系14F4(CGMCC?No.6036)產生。

5.產生根據以上1-4中任一項所述的單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞系，優選保藏號為CGMCC?No.6036的小鼠雜交瘤細胞系14F4。

6.一種用于診斷布魯氏病的診斷試劑或試劑盒，其包含根據以上1-4中任一項所述的單克隆抗體。

7.根據以上6所述的診斷試劑或試劑盒，其用于通過競爭ELISA(cELISA)方法來檢測樣品中的布魯氏菌抗體，優選所述樣品是來源于受試者血清。

8.根據以上6或7所述的診斷試劑或試劑盒，其中將sLPS作為抗原包被酶標板，洗滌后用封閉液封閉酶標板，將根據以上1-4中任一項所述的單克隆抗體和待測血清與包被抗原孵育，之后洗滌酶標板，加入抗鼠的酶標二抗，并且通過二抗相應檢測方法(如底物顯色法，例如TMB作為底物)判定結果。

9.根據以上8所述的診斷試劑或試劑盒，其中所述酶標二抗是HRP標記的山羊抗鼠IgG或綿羊抗鼠IgG。

10.根據以上1-4中任一項所述的單克隆抗體、根據以上5所述的雜交瘤細胞系或根據以上6-9中任一項所述的診斷試劑或試劑盒在制備體外檢測布魯氏菌或抗布魯氏菌抗體的試劑中的應用，優選所述檢測是通過競爭ELISA(cELISA)方法來進行的。

在本發明的一個優選實施方案中，采用常規的單抗制備方法，將布魯氏菌疫苗株M5-90免疫BALB/c小鼠，利用細胞融合技術獲得雜交瘤細胞。以M5-90、S-19和S2的sLPS作為抗原包被酶標板，對雜交瘤細胞進行篩選，獲得1株穩定分泌特異性單克隆抗體的細胞株，命名為14F4。亞型分析表明，14F4輕鏈亞類均為κ，重鏈為IgG3。效價實驗表明單抗14F4效價1：5.4×10⁵；交叉反應試驗表明，單抗14F4與大腸桿菌(O：157)、都柏林沙門氏菌(C79-86)全菌體及LPS無交叉反應。