[發明專利]一種納米材料表面進行的雜交鏈式反應技術的制備方法

有效

• 申請號: 201210538693.0
• 申請日: 2012-12-13
• 公開（公告）號: CN103014161A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 顏娟;宋世平;樊春海;何丹農
• 申請（專利權）人: 上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海東方易知識產權事務所 31121
• 代理人: 唐莉莎

技術領域

本發明涉及一種納米材料表面的雜交鏈式反應的制備方法，可用來構建生物檢測信號放大系統及用于細胞成像、藥物載體和腫瘤治療等領域，屬于納米材料的功能化領域。

背景技術

HCR技術（hybridization?chain?reaction）是?2004年美國加州理工學院應用和計算數學系副教授Niles?Pierce及同事開發了一種新方法可用于快速檢測特異的DNA序列。Pierce課題組利用HCR技術對多種不同mRNAs進行了同時成像分析。另外HCR也被用來檢測蛋白質和技術條件性地選擇靶向癌細胞，在特異性殺死癌細胞的同時又可以避免傳統化療所帶來的副作用。最近，Pierce實驗室又利用HCR檢測細胞核胚胎，利用反應形成的RNA分子激發細胞中蛋白激酶主導的天然病毒反應，誘導細胞凋亡程序，清楚癌細胞。在上述研究中，HCR擴增聚合物顯示了其深樣本穿透、高信噪比以及清晰的信號定位等特性。作為一種新型的擴增手段，目前針對HCR的相關研究面臨著以下兩點主要瓶頸：線性擴增的特性導致相對較低的檢測靈敏性；?假陽性信號：非引發鏈也常常能驅動HCR過程，導致假陽性結果。

現有的研究中，沒有刻意將納米材料表面進行雜交鏈式反應，該納米雜交鏈式反應技術（nanoHCR）本身不僅可以作為一個信號放大手段，另外其產物也可作為一種納米生物復合探針，不僅可以用于構建信號放大系統，同時也為構建新型藥物載體提供了新思路。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明提供一種在納米材料表面進行雜交鏈式反應的技術方法，可用于信號放大系統的構建，并且其產物可作為一種新型的藥物載體。

一種納米材料表面進行的雜交鏈式反應技術（hybridization?chain?reaction，HCR）的制備方法，其特征在于，將引發鏈組裝在納米材料表面，當溶液中存在亞穩態的發夾DNA結構時使得發夾結構打開，DNA發夾的構象由此發生改變暴露出發夾環，進而不斷結合和打開新的DNA發夾，驅動形成一條長的DNA聚合體，包括如下步驟：

（1）引發鏈加入到納米材料溶液中，進行組裝；

（2）組裝后溶液進行離心洗滌；

（3）洗滌后溶液中加入兩發夾結構，混合均勻后進行HCR反應；

（3）HCR產物經離心洗滌后進行檢測；

所述引發鏈是一段寡核苷酸序列，其一端5^，，或3^，可進行標記，如巰基、氨基、生物素標記。

所述納米材料與引發鏈的組裝濃度比例為1:1～1:5000。

所述納米材料與引發鏈的組裝條件為：室溫振蕩反應30分鐘～24小時，加入磷酸鹽緩沖液后，氯化鈉終濃度為0.1～0.15M；

所述組裝后洗滌條件為：4℃，3000rpm～150000rpm/min，5～20分鐘，1～4次，洗滌液為200～2000毫升，磷酸鹽緩沖液pH?為7.4。

所述亞穩態的發夾DNA結構數目至少為2個，當納米材料表面組裝的引發鏈將其一發夾結構打開時，暴露的單鏈部分又可作為引發鏈將另一發夾結構打開；可以由一條寡核苷酸序列構成，也可為幾條構成，如形成的DNA?tile結構中含有發夾結構。

所述HCR反應時，組裝在納米材料表面的引發鏈與發夾結構的比例為1:10～1:1000。

所述HCR反應條件為37℃，4～24小時。

所述HCR產物的離心條件為4℃，3000rpm～50000rpm/min，5分鐘，?3次，洗滌液為Milli-Q水。

所述HCR產物為一條DNA雙鏈，或為幾股DNA鏈，長度10nm～300nm。

檢測產物方法可為10%-15%聚丙烯酰胺凝膠電泳、0.8%-1%瓊脂糖電泳、原子力顯微鏡（tapping模式）等。

在生物檢測領域中，痕量生物分子的高靈敏及特異性檢測一直是亟待攻克的難題。目前較為常用的信號放大技術主要有PCR?(聚合酶鏈式反應)，以及RCA?（滾環擴增放大技術）。前者是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，另外因其涉及高溫變性過程，從而限制了其在體內及生物系統的應用；后者是一種高效的常溫擴增方法，擴增時需phi29聚合酶參與，同時也只適合體外擴增。而HCR技術，相較前兩者，過程更為簡單，只需一定比例的引發鏈和發夾結構在特定溫度下即可進行。