[發明專利]一種納米金-多肽生物探針及制備和應用方法

有效

• 申請號: 201210538692.6
• 申請日: 2012-12-13
• 公開（公告）號: CN103014117A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 顏娟;宋世平;樊春海;何丹農
• 申請（專利權）人: 上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;A61K47/42;A61K47/02
• 代理公司: 上海東方易知識產權事務所 31121
• 代理人: 唐莉莎

技術領域

本發明涉及一種探針及制備和應用方法，特別是涉及一種納米金-多肽生物探針及制備和應用方法，用于暗場顯微鏡下直接觀察納米生物探針與細胞的相互識別和作用，屬于納米材料的功能化及應用領域。

背景技術

納米金是研究很早的一種納米材料，通常在水溶液中以膠體金的形態存在。目前最經典的制備膠體金的方法是檸檬酸鈉還原法。膠體金的性質主要取決于金顆粒的直徑及其表面特性。由于其直徑在1-100nm之間，而大多數重要的生物分子如蛋白質、核酸等的尺寸都在這一尺度內，因此可以利用納米金作為探針進入生物組織內部探測生物分子的生理功能，進而在分子水平上揭示生命過程。

金納米粒子由于良好的生物相容性和無毒副作用，被廣泛應用生物分析化學，在生物分子標記和檢測、納米生物傳感器和納米生物芯片等技術的開發和應用方面取得了重要的進展：納米金探針在DNA檢測中的應用，納米金探針在免疫分析中的應用，納米金探針在單細胞分析中的應用，納米金探針在靶向藥物中的應用等。在上述應用中，雖然納米金顆粒呈紅色至紫色變化，有利于肉眼觀察，但直接將其用于光學檢測靈敏度仍受到限制。需將其與傳統的熒光染料標記法、銀染放大技術、表面增強拉曼散射技術等結合使用，則不可避免地遭遇熒光分子光漂白現象、涉及大型儀器如激光共聚焦熒光顯微鏡以及激光共聚焦拉曼光譜儀等，大大增加研究成本。而暗視野顯微鏡可分辨達0.004??m以上的微粒的存在和運動，這大大優于普通顯微鏡（最大分辨力為0.2??m）。另外，普通顯微鏡只要聚光器可拆卸，支架的口徑適于安裝暗場聚光器，即可改裝成暗場顯微鏡。對比共聚焦熒光顯微鏡等大型儀器，過程更為簡單易于操作。現在的研究中，較少利用暗場顯微鏡觀察納米生物探針與細胞相互作用及成像的報道。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明提供一種納米金-多肽生物探針及制備方法，同時提供該納米生物探針在細胞檢測、成像及作為載藥工具的應用。

一種納米金-多肽納米生物探針，其特征在于，將多肽組裝在納米金顆粒表面，在暗場顯微鏡下可直接觀察到該納米生物探針，將制備的此探針與細胞共培養后，可利用暗場顯微鏡觀察細胞內部及表面的納米金生物探針的數量、分布、形態以及其他的相互關系和作用。

所述納米金為還原法制備的膠體金顆粒，其顆粒直徑為15～70納米。

一種納米金-多肽納米生物探針的制備及應用方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將原料溶液加入到燒瓶中，加熱并冷凝回流至沸騰；

（2）沸騰溶液中快速加入還原劑溶液，持續攪拌，觀察顏色變化，顏色穩定無變化時，停止加熱，形成溶液液I；

（3）溶液I繼續攪拌室溫過夜后，過濾；

（4）由步驟（3）制備的納米金溶液中加入堿性溶液A，調節pH值；

（5）向步驟（4）得到的溶液中加入多肽溶液，混合均勻，進行組裝；?

（6）同樣條件下，向由步驟（3）制備的另一組納米金溶液中加入封閉劑；

（7）溶液離心，去上清，用雙蒸水重懸浮，洗滌過程重復三次；

（8）洗滌后的納米金生物探針用細胞培養液重懸??；

（9）將處理后的納米金生物探針加入到細胞培養皿中，于37℃，5.0%二氧化碳的細胞培養箱中與細胞共培養；

（10）將細胞用緩沖液洗滌后，用暗場顯微鏡觀察，可以選擇如下方法中的一種：

（a）將細胞用多聚甲醛或甲醛固定后，即可通過暗場顯微鏡直接觀察到細胞形態以及表面或內部的納米金-多肽生物探針；

（b）將細胞洗滌后，直接將活細胞通過暗場顯微鏡觀察到活細胞形態以及其內部或表面連接的納米金-多肽生物探針。

所述的原料溶液為0.01%的氯金酸水溶液10～500毫升。

所述還原劑可為檸檬酸三鈉、抗壞血酸、鞣酸、硼氫化鈉中的一種，所述還原劑的濃度為1%，加入量為0.05～10毫升。

步驟（4）所述堿性溶液A為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀水溶液中的一種，濃度為0.1～2M；所述調節后的溶液pH值為8～10。

步驟（5）所述多肽為N端標記有一個半胱氨酸；所述多肽溶液的濃度為25??M，體積為20～100微升。

步驟（6）所述封閉劑為0.1～2%?PEG6000水溶液，或0.1～2%酪蛋白溶液。

步驟（7）所述離心條件為：12000～5000rpm/min，5分鐘，4℃。