[發明專利]一種篩選EphB4激酶活性抑制劑的轉基因果蠅模型及其構建方法

有效

• 申請號: 201210537815.4
• 申請日: 2012-12-13
• 公開（公告）號: CN103238565A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 陳建明;楊麗容;韓家淮;傳超;李冬梅;韓偉;楊慧;李福英
• 申請（專利權）人: 國家海洋局第三海洋研究所;廈門大學
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 廈門市誠得知識產權代理事務所(普通合伙) 35209
• 代理人: 賴開慧

技術領域

本發明涉及動物模型及其構建方法，尤其涉及一種轉基因果蠅模型及其構建方法。

背景技術

Eph受體組成了受體酪氨酸激酶的最大家族，與它們的膜結合配體ephrin在胚胎圖式形成、神經靶向、血管發育和成體新血管形成中發揮重要作用。有越來越多的證據表明Eph受體信號通路促進人體許多腫瘤的的發生，如直接促進腫瘤生長或通過形成腫瘤血管間接促進腫瘤形成。Eph受體及其配體在乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等腫瘤中被檢測到過量表達。

特別是EphB4，它是Eph家族中研究的最多的蛋白。使用小干擾RNA或反義寡核苷酸鏈抑制EphB4的表達會進而抑制細胞的增殖、存活和PC3前列腺癌細胞的侵襲。使用可溶的EphB4的胞外結構域會抑制腫瘤生長。干擾內皮細胞中EphB4的信號通路會改變腫瘤血管的形態。這些觀察提示我們EphB4在腫瘤及其血管生長中發揮重要作用。EphB4（又稱HTK）和它的配體ephrinB2（HTKL），在血管和淋巴管網絡的發育中發揮重要作用。EphB4特異表達在靜脈上皮細胞，而ephrinB2在血管和淋巴管網絡發育的早期階段特異表達在動脈上皮細胞。小鼠中，EphB4基因的缺陷將會導致毛細血管連接的障礙，并最終導致小鼠在胚胎期死亡。胚胎發生中，EphB4表達在血細胞生成和血管發育的部位。EphB4在乳腺組織中的異常表達引起乳腺結構的無序、組織功能的損壞以及傾向于發生癌變。

Nai-Ying?Yang等發現EphB4調節小鼠黑色素瘤細胞的遷移。惡性程度高的黑色素瘤細胞表達更高水平的EphB4，遷移的也比惡性程度低的快。當抑制EphB4的正向信號通路時，腫瘤細胞遷移也變慢。與此相比，活性EphB4的過表達明顯增強了細胞的遷移能力。EphB4在細胞遷移和細胞形態上的效應需要它的激酶活性，當在細胞里過表達無激酶活性的EphB4時，細胞的遷移受到抑制。Nai-Ying?Yang在文章中提到EphB4之所以可以調節細胞遷移是因為參與肌動蛋白的重新改造。Heroult?M等甄選了一組人類腫瘤細胞系，并確定都有EphB4的表達。

由于易于飼養及便于遺傳學操作，果蠅被成功的作為模式生物應用到發育遺傳學、信號轉導和細胞生物學的研究。高水平的基因和信號的保守性，以及哺乳動物與果蠅之間的細胞生理生化過程的相似性，使果蠅模型便于研究人類基因。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提供一種篩選EphB4激酶活性抑制劑的果蠅模型的構建方法。

為實現上述目的，本發明提供以下具體技術方案：

由雄性轉基因果蠅與雌性GMR-Gal4的處女蠅雜交得到子I代果蠅，挑其所述子I代果蠅的的處女蠅與yw/Y;+/Cyo雄蠅雜交，后代挑選翹翅rough?eye的雄蠅，即為果蠅模型中的雄性果蠅；用得到的果蠅模型中的雄性果蠅與+/FM7;+/Cyo雜交，后代挑選bar眼、翹翅、rough?eye的雌蠅，得到的雌蠅再與果蠅模型中的雄性果蠅雜交，后代挑選無bar眼、翹翅、rough?eye的雌蠅，即為果蠅模型中的雌性果蠅。

所述雄性轉基因果蠅的基因型為EphB4?Kinase?domain/Y或EphB4?Kinase?domain。

所述雄性轉基因果蠅是將5’端具有來自酵母上游激活序列的人EphB4?Kinase?domain，整合到果蠅染色體基因組中得到的。

所述雄性轉基因果蠅的制備方法為：

第一步，先進行載體的構建，即將PUAST?改造為?PUAST-EGFP載體。

第二步，將PUAST-EGFP改造為?PUAST-MYR-EGFP轉基因載體：首先設計引物制備得到十四烷酰化修飾識別序列(MYR，SEQ?ID?NO:1)，將雙酶切的十四烷酰化修飾識別序列插入到同樣酶切的PUAST-EGFP載體中即得到?PUAST-MYR-EGFP轉基因載體；

第三步，PUAST-MYR-hEphB4-EGFP重組質粒的構建：將人hEphB4?基因的Kinase?domain（即SEQ?ID?NO:4）克隆進PUAST-MYR-EGFP轉基因果蠅載體里，形成PUAST-MYR-hEphB4-EGFP重組質粒；