[發(fā)明專利]嗜熱長(zhǎng)鏈烷醇醇脫氫酶及其晶體結(jié)構(gòu)

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210537043.4
• 申請(qǐng)日: 2012-12-10
• 公開（公告）號(hào): CN102936586A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬克·巴特蘭姆;王瑩瑩;紀(jì)玉蕊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/04
• 分類號(hào): C12N9/04
• 代理公司: 天津佳盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及到用X射線晶體衍射方法確定的一種嗜熱長(zhǎng)鏈烷醇醇脫氫酶晶體結(jié)構(gòu)，屬于分子生物學(xué)和應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

醇脫氫酶（alcohol?dehydrogenase,ADHs,EC?1.1.1.1）是生物體內(nèi)重要的氧化還原劑之一，很多醇類代謝都是通過(guò)醇脫氫酶催化完成的。在動(dòng)物、植物、微生物、真核生物以及原核細(xì)菌中都已發(fā)現(xiàn)醇脫氫酶，至少有25個(gè)EC編號(hào)的酶被稱為醇脫氫酶。

醇脫氫酶能夠催化醇類物質(zhì)到醛類物質(zhì)的可逆氧化。ADHs的底物范圍很廣，其所起到的生理學(xué)作用也是多種多樣的。在微生物烷烴類物質(zhì)的末端降解途徑中，ADHs催化反應(yīng)中的第二步，末端降解途徑如圖3所示。

在正烷烴類物質(zhì)末端降解途徑中，由烷烴加氧酶將烷烴氧化為長(zhǎng)鏈烷醇，再由醇脫氫酶進(jìn)一步脫氫為長(zhǎng)鏈烷醛，生成的長(zhǎng)鏈烷醛在醛脫氫酶的作用下脫氫生成長(zhǎng)鏈脂肪酸。在長(zhǎng)鏈脂肪酸輔酶A連接酶作用下生成長(zhǎng)鏈烷酸輔酶A后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終完全氧化為二氧化碳和水。

醇脫氫酶來(lái)源廣泛，種類繁多。依賴NAD(P)H的醇脫氫酶，根據(jù)它們的分子性質(zhì)和金屬含量，能夠分為三類。I型：Zn²⁺依賴的長(zhǎng)鏈醇脫氫酶（每個(gè)亞基含有約350個(gè)氨基酸殘基），如來(lái)自于大腸桿菌Escherichia?coli的菌株K-12中的YqhD。II型：不含有金屬的短鏈醇脫氫酶（每個(gè)亞基中含有約250個(gè)氨基酸殘基），如來(lái)自于棲熱菌屬的Thermusthermophilus?HB27中的醇脫氫酶即屬于該型脫氫酶。III型：含鐵的/由鐵激活的長(zhǎng)鏈醇脫氫酶（每個(gè)亞基中含有385-900個(gè)氨基酸殘基），如來(lái)自于發(fā)酵單胞菌屬的Zymomonasmobilis?ZM4中的醇脫氫酶，該醇脫氫酶需要鐵離子存在才能活化發(fā)揮功能，以及來(lái)自于大腸桿菌E.coli的菌株ECL1中的含鐵的醇脫氫酶。

不動(dòng)桿菌屬中菌株HO1N對(duì)于十六烷醇具有降解活性。從一些已知的烷烴降解細(xì)菌，如假單胞菌屬Pseudomonas?fluorescens?NRRL?B-1244、假單胞菌屬Pseudomonas?butanovoraATCC?43655、不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter?M-1，以及一些尚未了解具有降解烴類物質(zhì)功能的細(xì)菌，如土壤芽孢桿菌屬Geobacillus?stearothermophilus?LLD-R、熱球菌屬Pyrococcusfuriosus?DSM?3638，以及黃桿菌屬Flavobacterium?frigidimaris?KUC-1，等菌株都表現(xiàn)出了對(duì)于短鏈長(zhǎng)到中等鏈長(zhǎng)（C2-C14）烷基醇的降解活性。然而，具有降解較長(zhǎng)鏈長(zhǎng)（C15及以上）烷基醇的醇脫氫酶到目前還沒有報(bào)道。目前研究最為清楚的是酵母菌中的醇脫氫酶，其為四聚體，單個(gè)亞基肽鏈含有347個(gè)氨基酸殘基，亞基分子量為35000。酵母醇脫氫酶對(duì)底物專一性強(qiáng)，對(duì)乙醇及其他直鏈伯醇活性較高，只對(duì)少數(shù)仲醇和側(cè)鏈烷醇具有活性。

在石油烴降解途徑中，嗜熱脫氮芽孢桿菌（Geobacillus?thermodenitrificans）NG80-2中的長(zhǎng)鏈烷醇醇脫氫酶是十分重要的關(guān)鍵酶，其能夠耐高溫并高效利用烷烴單加氧酶的催化產(chǎn)物長(zhǎng)鏈烷醇，使其進(jìn)一步脫氫，提高烷烴降解途徑中的催化效率；另一方面，它有著比長(zhǎng)鏈烷烴單加氧酶更廣泛的底物范圍，不僅能夠催化長(zhǎng)鏈烷醇，還對(duì)短鏈醇有很高的催化能力。因此，對(duì)長(zhǎng)鏈烷醇醇脫氫酶的研究不僅有利于深入了解嗜熱脫氮芽孢桿菌（Geobacillus?thermodenitrificans）NG80-2降解長(zhǎng)鏈烷烴途徑的機(jī)制，為探索其它烷烴降解菌的代謝途徑提供理論基礎(chǔ)，對(duì)該酶構(gòu)建高效表達(dá)工程菌株及大量純化更具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的嗜熱長(zhǎng)鏈烷醇醇脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)相同的公開文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明目的是為了更加深入了解嗜熱脫氮芽孢桿菌（Geobacillus?thermodenitrificans）NG80-2中參與正烷烴末端降解途徑中的嗜熱長(zhǎng)鏈烷醇醇脫氫酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，提供嗜熱長(zhǎng)鏈烷醇醇脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)；本發(fā)明通過(guò)蛋白質(zhì)表達(dá)、純化和懸滴氣相擴(kuò)散結(jié)晶方法獲得了該嗜熱長(zhǎng)鏈烷醇醇脫氫酶的晶體，并通過(guò)X射線衍射方法對(duì)醇脫氫酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。