[發(fā)明專利]一種細(xì)菌通用PCR檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210536954.5
• 申請(qǐng)日: 2012-12-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103060440A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任常寶;邵定勇;陳瑞愛(ài);黃紅亮;謝小雨;唐兆新
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司;廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 廣州市越秀區(qū)哲力專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)菌檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)菌通用的PCR檢測(cè)方法，用于所有細(xì)菌的檢測(cè)。

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背景技術(shù)

疫苗等生物制品的生產(chǎn)需要遵從藥品產(chǎn)生質(zhì)量管理規(guī)范，并且在規(guī)范的質(zhì)量檢測(cè)體系經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的檢測(cè)才能確保疫苗安全性和有效性，以求最大效率地提高接種后的效應(yīng)作用，最大限度地降低免疫接種后的不良反應(yīng)。微生物檢驗(yàn)是醫(yī)療器械、生物藥品等生產(chǎn)制造行業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要內(nèi)容，其內(nèi)容主要包括以培養(yǎng)方法檢測(cè)是否有細(xì)菌、支原體等微生物的污染；其中菌檢是微生物檢測(cè)的最基本也是最重要的組成部分，純菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)諸如減毒活菌苗自身菌體的活菌量、總菌量以及是否有其他雜菌的存在；以及以CHO細(xì)胞毒試驗(yàn)、HeLa細(xì)胞毒等試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌毒素的活力等。傳統(tǒng)方法對(duì)檢測(cè)場(chǎng)所和檢測(cè)人員素質(zhì)要求較高，且培養(yǎng)基的配制、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的把握等繁瑣，且需時(shí)較長(zhǎng)，不利于快速做出判斷。

原核生物的r?RNA含有3種類型：23S、16S、5SrRNA，它們分別含有2,900、1540和120個(gè)核苷酸。16SrRNA為核糖體RNA的一個(gè)亞基，其編碼基因是16SrDNA；16SrDNA長(zhǎng)度適中信息量較大、易分析，且在有多個(gè)區(qū)段保守性，根據(jù)這些保守區(qū)可以設(shè)計(jì)出細(xì)菌通用物，可以擴(kuò)增出具有細(xì)菌高度特異性的片段，是生物的種屬鑒定和系統(tǒng)的重要分子基礎(chǔ)。以16SrDNA為目的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)能精確的揭示微生物種類和遺傳的多樣性，從而16SrDNA序列分析成了微生物分類鑒定主要依據(jù)。隨著核酸測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的微生物的16SrDNA序列被測(cè)定并收入國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)中，16SrDNA序列分析技術(shù)在微生物分類鑒定及分子檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)菌通用的PCR檢測(cè)方法，可快速鑒別不同細(xì)菌，敏感性、準(zhǔn)確性優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，解決了特異性PCR逐個(gè)篩選鑒別病原的繁瑣性，克服了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法的限制，操作方便，檢測(cè)快速準(zhǔn)確且靈敏度高。

為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

一種細(xì)菌通用的PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1）樣品處理：

無(wú)菌條件下從樣本中分離細(xì)菌，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、血液瓊脂平板和麥康凱平板上，置恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)，獲得單菌落；單菌落用單菌落接種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)；收集菌液，在液氮和35-40℃下，分別反復(fù)凍融裂解細(xì)菌或超聲波破碎細(xì)菌，之后消化處理；

2）核酸提取：

將處理后的樣本，用總核酸試劑盒提取核酸，核酸提取后用分光光度計(jì)測(cè)核酸濃度；

3）PCR擴(kuò)增：

設(shè)計(jì)引物SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2加入到PCR反應(yīng)體系中對(duì)細(xì)菌DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

4）PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序：

PCR產(chǎn)物純化回收，使用分光光度計(jì)檢測(cè)核酸濃度，回收產(chǎn)物16℃過(guò)夜連接PMD-18T克隆載體進(jìn)行克隆；隨機(jī)挑選克隆產(chǎn)物中的10個(gè)菌落，分別于AMP+LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3～6小時(shí)，用上述引物SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2進(jìn)行PCR進(jìn)行鑒定，電泳觀測(cè)結(jié)果，PCR結(jié)果陽(yáng)性的樣本菌液送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

步驟1）中恒溫培養(yǎng)箱的溫度為35-40℃，培養(yǎng)時(shí)間為18-24h。

步驟1）中消化處理過(guò)程為1ml的細(xì)菌中分別加入5μl的RNase，及10×Buffer，37℃消化1.5小時(shí)后，80℃、5min終止消化。

步驟3）中所述PCR反應(yīng)體系為細(xì)菌DNA模板1-10μl、10×PCR?buffer5-20μl、dNTPs?Mixture4-10μl、r?Taq0.25μl、ddH2O補(bǔ)足50μl；引物的加入量為16SrDNA?F1-μl、16SrDNA?R1μl。

步驟3）中所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?6℃，預(yù)變性2min；96℃，30s；?55℃，30s；72℃，60s；35個(gè)循環(huán)，72℃，10min，4℃保存；擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。

步驟4）中克隆程序?yàn)閷⑦B接產(chǎn)物加入至100μl的DH5α感受態(tài)中，冰浴30min后，于42℃水浴熱激90s，置冰上3～5min后，加入500μl的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h；將培養(yǎng)液3000rpm離心3min，棄去400μl培養(yǎng)基，剩余培養(yǎng)基重新與離心細(xì)菌沉淀混合，混合液涂布于Amp-LB固體培基，充分吸收后，于37℃倒置培養(yǎng)12～16h。