[發明專利]一種檢測 VEGFR2 mRNA 基因表達量的試劑盒及方法

無效

• 申請號: 201210534504.2
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN102994640A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 郭成賢;張偉;陳小平;劉昭前;周宏灝
• 申請（專利權）人: 周宏灝
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏

1.一種檢測?VEGFR2?mRNA?基因表達量的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括以下組成部分：

（1）?VEGFR2基因標準品：含有VEGFR2基因編碼序列的重組載體，所述VEGFR2基因編碼序列如SEQ?ID?NO.1所示；

（2）內對照B2M基因標準品：含有B2M基因編碼序列的重組載體，所述B2M基因編碼序列如SEQ?ID?NO.2所示；

（3）檢測VEGFR2基因的上、下游引物：

VEGFR2-上游引物：5’-?ACTGTCATCCTTACCAATCCCA?-3’；

VEGFR2-下游引物：5’-?ATCTGGGGTGGGACATACAC?-3’；

（4）檢測B2M基因的上、下游引物：

B2M-上游引物：5’-?CCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGA?-3’；

B2M-下游引物：5’-?TTCATCCAATCCAAATGCGGC?-3’。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述含有VEGFR2基因編碼序列的重組載體和含有B2M基因編碼序列的重組載體中的空載體均為pUC57載體。

3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括逆轉錄緩沖液、逆轉錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆轉錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶。

4.一種基于權利要求1至3任一項所述試劑盒檢測VEGFR2?mRNA基因表達量的方法，包括如下步驟：

（1）從待測標本中提取總RNA，測定RNA濃度，加入逆轉錄緩沖液、逆轉錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆轉錄酶，將RNA逆轉錄為cDNA；

（2）分別將已知拷貝數的VEGFR2和內對照B2M基因標準品倍比稀釋至10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10個拷貝數/μl；

（3）分別以步驟（1）所制備的待測cDNA及步驟（2）倍比稀釋的VEGFR2基因標準品為模板，加入內對照B2M基因標準品，檢測VEGFR2基因的上、下游引物，檢測內對照B2M基因的上、下游引物，定量PCR緩沖液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，進行熒光定量PCR；

（4）根據倍比稀釋的VEGFR2和內對照B2M基因標準品的循環閾值與初始拷貝數分別繪制VEGFR2和內對照B2M基因標準曲線，再根據待測cDNA的循環閾值，從標準曲線上讀取其含有的VEGFR2基因和內對照B2M基因的初始拷貝數。

5.根據權利要求?4?所述的方法，其特征在于：所述步驟（3）的PCR擴增條件為：95^oC預變性3分鐘，然后95^oC變性30秒、57^oC退火40秒，共38個循環。