[發明專利]高效分泌表達芋螺毒素的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株

無效

• 申請號: 201210533955.4
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN102978165A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 余瓊
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/12;C12N15/79;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種基因工程細胞株。

背景技術

芋螺(Conus)多數生活在熱帶海洋的淺水區，種類繁多，目前發現的芋螺有500多種，根據其不同種的外形、花紋及色澤等進行命名和分類。捕食時，它們會向獵物投射接連毒腺管和毒囊的針狀齒舌，并注射毒液，獵物一旦被擊中，就立刻麻痹，成為芋螺的食物，這種毒液的主要成分便是芋螺毒素(conotoxin，CTx)。

芋螺毒素(conotoxin，CTx)是一類來源于芋螺毒液的活性多肽。芋螺毒素通常是由10~46個氨基酸殘基組成，分子量小，結構多樣，富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫鍵骨架，主要作用于鈉、鉀、鈣等多種離子通道和神經遞質受體，阻斷或增強神經興奮信號的傳遞，是迄今發現分子量最小的一類多肽毒素。芋螺毒素具雙重效應，一方面阻斷痛覺傳遞而具鎮痛效應，另一方面抑制興奮毒性(excitotxic）神經遞質釋放，阻止神經元細胞病理性鈣內流而有神經保護作用。因其直接作用于鈣通道，無需第二信使或G蛋白，故不成癮，將成為慢性重癥疼痛如晚期惡性腫瘤和AIDS病，取代用阿片類成癮的神經性疾病的新一代藥物。

芋螺毒素因生物活性強，作用靶點廣且具有高度選擇性，可直接作用藥物，又可以作為設計新藥的先導化合物，具有重要的理論研究價值和應用價值。但是從芋螺體內獲得芋螺毒素的數量遠遠不能滿足市場的需要，因此利用生物轉基因技術獲得表達芋螺毒素的工程菌株成為發展的的趨勢。

但是目前所知的轉基因工程菌株都存在芋螺毒素分泌表達量低的缺陷，而且有研究表明ω-芋螺毒素中只有天然二硫鍵的形成才能促使進一步正確的折疊。因此，如何保證轉基因后芋螺毒素的二級結構，保持其生物活性，成為困擾芋螺毒素轉基因設計的一大難題。現有的芋螺毒素重組菌（或轉基因菌株）都采用在發酵上清液中加入β-巰基乙醇將二硫鍵打開，然后再透析過夜使其在空氣中緩慢氧化，最終形成正確的二硫鍵配對形式。但這種方式不適用于工業化大規模生產，且成本高，生產周期長，也許存在一定的風險。

發明內容

本發明要解決現有轉基因工程菌株芋螺毒素分泌表達量低，且需要在發酵上清液中加入β-巰基乙醇再透析過夜，導致成本高，生產周期長，風險增加，不適合工業化大規模生產的問題，而提供的一株高效分泌表達芋螺毒素的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株。

本發明高效分泌表達芋螺毒素的中國倉鼠卵巢基因工程細胞株按以下步驟制備：

一、設計芋螺毒素轉基因序列，基因序列如SEQ?ID?NO：1所示；?

二、合成芋螺毒素轉基因DNA片段，然后導入T載體中；

三、目的片段雙酶切，用BamHI及EcoRⅠ雙酶切消化T載體，反應體系為

酶切反應條件為37℃放置10h，然后將酶切產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNA?GEL?EXTRACTION?KIT純化回收，得到插入片段CTx；

四、質粒載體雙酶切：用BamHI和EcoRⅠ雙酶切消化質粒載體pcDNA3.1/V5-His-C，反應體系為

酶切反應條件為37℃放置10h，然后將酶切產物用0.6%瓊脂糖凝膠電泳，再用DNA?GEL?EXTRACTION?KIT純化回收，得到酶切后的載體pcDNA3.1/V5-His-C；

五、插入片段CTx與經過雙酶切的載體pcDNA3.1/V5-His-C連接，連接反應體系為

連接反應條件為16℃放置過夜，獲得連接產物重組質粒pcDNA3.1/V5-His-C-CTx；?

六、重組質粒轉染CHO：將構建好的重組質粒pcDNA3.1/V5-His-C-CTx與質粒pDCH1P11混合，使用Lipofeetmine^TM?2000?Reagent共轉染CHO-dhfr^-細胞，在24孔板中進行轉染，細胞達到95%融合時，將培養基更換為無抗生素、無血清的CHO-S-SFMⅡ，500μL/孔，轉染6h后更換含100mL/L?FBS、不含HT和NAA的CHO-S-SFMⅡ，繼續培養48h，用ELISA試劑盒鑒定陽性轉染的細胞按1:10傳代，24h細胞貼壁后更換為不含HT和NAA、含G418??0.75mg/L和FBS?100mL/L的選擇性培養基，培養14～16d后有陽性克隆形成，然后用定向消化的方法將陽性克隆轉入24孔板，又傳代至12孔板，經?ELISA試劑盒測定對陽性高表達的細胞克隆進行擴大培養；