[發明專利]一種骨髓間充質干細胞的體外擴增純化培養方法及培養基

無效

• 申請號: 201210533944.6
• 申請日: 2012-12-08
• 公開（公告）號: CN102978156A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 李靜;周國順;戴利成
• 申請（專利權）人: 湖州市中心醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 趙芳;徐關壽

技術領域

本發明要求保護一種利于骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的骨髓間充質干細胞體外擴增純化培養方法，以及在培養過程中所用的細胞培養基。

背景技術

骨髓間充質干細胞在適當的條件刺激下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等細胞類型，而且易于分離培養，具有較強的自我更新、分化能力和免疫抑制等優點，使其在組織器官缺損性疾病、組織器官退行性疾病以及細胞治療和組織工程領域具有重要的應用前景。近來有眾多的國內外研究探索骨髓間充質干細胞的體外分離和培養方法，主要有貼壁分離、密度梯度離心和細胞分選等方法，結果顯示通過貼壁傳代分離的細胞純度低，梯度離心和細胞分選可獲得較高純度的細胞，而細胞活力相對較低，且所需骨髓量較大，影響后續的研究和應用。而且通過這些方法獲得的骨髓間充質干細胞在傳代培養過程中逐漸失去增殖分化能力。近來有文獻報道將一些細胞因子應用于干細胞相關的研究中，對骨髓間充質干細胞的體外生長具有一定的生物學效應。

發明內容

本發明目的一種利于骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的骨髓間充質干細胞體外擴增純化培養方法，以及在培養過程中所用的細胞培養基。

本發明采用的技術方案是：

一種骨髓間充質干細胞的體外擴增純化培養方法，所述方法包括：取骨髓細胞，經篩網過濾后的單細胞懸液接種于培養皿中進行貼壁培養，初始接種密度2~5×10⁶個/mL（優選約為5×10⁶個/mL）細胞培養基，培養3~5小時（優選為3小時）后更換細胞培養基（組成同前），此后每隔8~15小時（優選12小時）再次更換細胞培養基（組成同前），直到接種后60~80小時（優選為75小時），然后再每隔3天更換細胞培養基（組成同前）繼續培養，直到細胞長至80%~90%融合，以胰酶消化，消化時間不超過2分鐘，細胞傳代繼續培養，獲得純化后的骨髓間充質干細胞；所述細胞培養基終濃度組成如下：bFGF?8~12?μg/L，EGF?8~12?μg/L，PDGF-BB?8~12?μg/L，胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為基礎培養基；所述基礎培養基為DMEM培養液、F12培養液或其混合物。

優選的，所述細胞培養基終濃度組成如下：bFGF（小鼠堿性成纖維細胞生長因子）?10?μg/L，EGF（小鼠表皮生長因子）?10?μg/L，PDGF-BB（小鼠血小板衍生生長因子-BB）10?μg/L，胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為基礎培養基；所述基礎培養基為DMEM培養液和F12培養液體積比1:1的混合液。??

細胞傳代具體步驟包括：PBS緩沖液洗滌細胞，添加0.25%胰酶（含有0.02%EDTA）室溫消化細胞，添加完全培養基終止消化，細胞懸液經離心分離去除上層清液，再添加完全培養基懸浮細胞，接種于新的培養皿中繼續培養，細胞接種密度為5×10⁵/mL。完全培養基即細胞培養基中去掉生長因子成分，其組成如下：胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為基礎培養基；所述基礎培養基為DMEM培養液、F12培養液或其混合物。

本發明還涉及一種用于骨髓間充質干細胞的體外擴增純化培養的細胞培養基，其終濃度組成如下：bFGF?8~12?μg/L，EGF?8~12?μg/L，PDGF-BB?8~12?μg/L，胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為基礎培養基；所述基礎培養基為DMEM培養液、F12培養液或其混合物。

優選的，所述細胞培養基終濃度組成如下：bFGF?10?μg/L，EGF?10?μg/L，PDGF-BB?10?μg/L，胎牛血清10%，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/L，溶劑為基礎培養基；所述基礎培養基為DMEM培養液和F12培養液體積比1:1的混合液。

本發明在以往的研究基礎上，采用細胞貼壁傳代和培養液中添加細胞因子（bFGF?、EGF?和PDGF-BB）相結合的方法，獲得的骨髓干細胞純度高，體外增殖能力強，并且具有較好的向成骨細胞分化的能力。