[發明專利]一株產莽草酸的大腸桿菌重組菌及其構建方法及應用

無效

• 申請號: 201210533913.0
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN102994439A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 陳獻忠;李明明;王正祥
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一株產莽草酸的大腸桿菌重組菌株，其分類命名為大腸桿菌（Escherichia?coli）B0013（SA4/pTHGAA），該重組菌株染色體DNA中有4個基因被刪除，同時有1~3個基因過量表達；

刪除的基因為：莽草酸激酶I基因aroK，莽草酸激酶II基因aroL，葡萄糖磷酸轉移酶系統的關鍵蛋白EIIBC^Glc基因ptsG和圭尼酸/莽草酸脫氫酶基因ydiB；

過量表達的基因是：3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因aroG*，轉酮酶A基因tktA，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A基因ppsA中的1~3個。

2.權利要求1所述產莽草酸的大腸桿菌重組菌株的構建方法，其特征在于步驟如下：

（1）利用同源重組原理，以野生型大腸桿菌B0013為出發菌株，依次刪除CICIM?B0013染色體上aroK，aroL，ptsG和ydiB基因，獲得菌株B0013?SA4；

（2）利用PCR技術分別擴增來源于CICIM?B0013菌株的aroG*，tktA和ppsA基因片段；

（3）將aroG*，tktA和ppsA基因插入pTH18Kr載體中，構建過量表達這三個基因的表達載體的重組質粒，命名為pTHGAA；

（4）將步驟（3）獲得的表達載體pTHGAA導入步驟（1）的B0013?SA4菌株中，篩選獲得轉化子，命名為大腸桿菌B0013（SA4/pTHGAA）。

3.根據權利要求2所述產莽草酸的大腸桿菌重組菌株的構建方法，其特征在于aroG*基因是解除了反饋抑制的突變基因，其突變位點在該基因編碼蛋白的第146位氨基酸位點，Asp?146?Asn；即將該基因編碼蛋白中146位的天冬氨酸密碼子突變為天冬酰酸。

4.根據權利要求2所述產莽草酸的大腸桿菌重組菌株的構建方法，其特征在于步驟（3）中過量表達基因所用表達載體是pTH18kr，但不僅限于該載體。

5.用權利要求1所述大腸桿菌重組菌株發酵生產莽草酸的方法，其特征在于：從LB平板上挑取大腸桿菌B0013（SA4/pTHGAA）單菌落接種于LB液體培養基中，37℃培養過夜，然后按4%的接種量接種于發酵培養基中，37℃培養，發酵過程中控制碳源濃度在10?g/L，發酵時間60?h；

發酵培養基組成以g/?L計為：Na₂HPO₄·H₂O?13，?KH₂PO₄?3，NaCl?0.5，NH₄Cl?0.1，MgSO₄?1.2，L-苯丙氨酸?0.7，L-色氨酸0.35，L-酪氨酸0.7，檸檬酸鐵銨0.3，一水合檸檬酸2.1，對羥基苯甲酸0.01，對氨基苯甲酸鉀0.01，2,3-二羥基苯甲酸0.01，酵母抽提物15，蛋白胨20，碳源25，以純凈水配制；

所使用的碳源為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其組合；發酵結束時莽草酸的含量達到20g/L。