[發(fā)明專利]一種利用雄蕊瓣化標(biāo)記不結(jié)球白菜雄性不育基因的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210533595.8
• 申請(qǐng)日: 2012-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN102978287A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡春梅;李樹燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用雄蕊瓣化標(biāo)記不結(jié)球白菜雄性不育基因的方法，其特征在于：用標(biāo)記引物AFLP17，左端引物序列：GACTGCGTACCAATTCAGC，右端引物序列：GATGAGTCCTGAGTAATGC；或者用標(biāo)記引物SCAR33，左端引物序列：CTGAGTAATCGGGCATGCAA，右端引物序列：GTAATCGCAGCCCAGACAAC。擴(kuò)增由雄蕊瓣化品系及其保持系RNA反轉(zhuǎn)錄合成的DNA，如果能夠擴(kuò)增出300bp的片段，則標(biāo)志著不結(jié)球白菜雄性不育基因的存在。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用雄蕊瓣化標(biāo)記不結(jié)球白菜雄性不育基因的方法，其中采用的AFLP17和SCAR33兩種分子標(biāo)記引物是通過以下方法篩選獲得的：?

1)選用不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052；?

2)用于篩選標(biāo)記引物的DNA模板的制備：?

提取植物組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈DNA，利用識(shí)別序列分別6bp和4bp的限制性內(nèi)切酶EcoRI和MseI將雙鏈DNA酶切并加上適宜的接頭，使用相應(yīng)的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增獲得大量的模板，產(chǎn)物稀釋后用于選擇性擴(kuò)增；?

3)標(biāo)記引物的篩選：?

使用64對(duì)選擇性擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系為20μl，其中模板2μl，左端引物1μl，右端引物1μl，10×PCR?buffer(Mg²⁺free)2μl，dNTP(2.5mM)1.6μl，Mg²⁺1.2μl，5U?rTaq?0.2μl，加ddH₂O至20μl；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min，第一輪擴(kuò)增參數(shù)：94℃30s，65℃30s，72℃45s，12輪循環(huán)，每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃。第二輪擴(kuò)增參數(shù)：94℃30s，56℃30s，72℃45s，重復(fù)23個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min；PCR產(chǎn)物于6％的變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離分析，電泳結(jié)束后通過銀染法顯示條帶，篩選出在雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052間的多態(tài)性片段，從而獲得不結(jié)球白菜雄性不育基因的1個(gè)300bp的AFLP標(biāo)記片段，其標(biāo)記引物為AFLP17；?

4)差異片段的回收、克隆及測(cè)序：?

刮下差異條帶置于1.5ml離心管，加入100μl?dd?H2O，在沸水中煮30分鐘，冷卻后取2μl做模板，使用預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收與純化；回收得到的DNA與PMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌；菌液PCR檢測(cè)，選取有單一目的條帶的送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序；?

5)將AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記：?

根據(jù)AFLP擴(kuò)增特異序列的測(cè)序結(jié)果，利用Primer?Premier?5.0設(shè)計(jì)SCAR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)?增，反應(yīng)體系20μl，其中10×PCR?buffer(Mg²⁺free)2μl，Mg²⁺1.2μl，dNTP(2.5mM)1.6μl，引物各1μl，雙鏈DNA?2μl，5U?rTaq?0.2μl，加ddH₂O至20μl；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸80s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，PCR產(chǎn)物于1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在UVP成像系統(tǒng)上自動(dòng)成像，篩選出不結(jié)球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052間的多態(tài)性片段，從而獲得不結(jié)球白菜雄性不育基因的1個(gè)300bp的SCAR標(biāo)記片段，其標(biāo)記引物為SCAR33。?