[發明專利]一種利用雄蕊瓣化標記不結球白菜雄性不育基因的方法

無效

• 申請號: 201210533595.8
• 申請日: 2012-12-12
• 公開（公告）號: CN102978287A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 胡春梅;李樹燕
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用雄蕊瓣化標記不結球白菜雄性不育基因的方法，其特征在于：用標記引物AFLP17，左端引物序列：GACTGCGTACCAATTCAGC，右端引物序列：GATGAGTCCTGAGTAATGC；或者用標記引物SCAR33，左端引物序列：CTGAGTAATCGGGCATGCAA，右端引物序列：GTAATCGCAGCCCAGACAAC。擴增由雄蕊瓣化品系及其保持系RNA反轉錄合成的DNA，如果能夠擴增出300bp的片段，則標志著不結球白菜雄性不育基因的存在。

2.根據權利要求1所述的一種利用雄蕊瓣化標記不結球白菜雄性不育基因的方法，其中采用的AFLP17和SCAR33兩種分子標記引物是通過以下方法篩選獲得的：?

1)選用不結球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052；?

2)用于篩選標記引物的DNA模板的制備：?

提取植物組織總RNA并反轉錄合成雙鏈DNA，利用識別序列分別6bp和4bp的限制性內切酶EcoRI和MseI將雙鏈DNA酶切并加上適宜的接頭，使用相應的引物進行預擴增獲得大量的模板，產物稀釋后用于選擇性擴增；?

3)標記引物的篩選：?

使用64對選擇性擴增引物進行PCR反應，體系為20μl，其中模板2μl，左端引物1μl，右端引物1μl，10×PCR?buffer(Mg²⁺free)2μl，dNTP(2.5mM)1.6μl，Mg²⁺1.2μl，5U?rTaq?0.2μl，加ddH₂O至20μl；PCR反應程序為：94℃預變性2min，第一輪擴增參數：94℃30s，65℃30s，72℃45s，12輪循環，每輪循環溫度遞減0.7℃。第二輪擴增參數：94℃30s，56℃30s，72℃45s，重復23個循環，最后72℃延伸5min；PCR產物于6％的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離分析，電泳結束后通過銀染法顯示條帶，篩選出在雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052間的多態性片段，從而獲得不結球白菜雄性不育基因的1個300bp的AFLP標記片段，其標記引物為AFLP17；?

4)差異片段的回收、克隆及測序：?

刮下差異條帶置于1.5ml離心管，加入100μl?dd?H2O，在沸水中煮30分鐘，冷卻后取2μl做模板，使用預擴增引物進行PCR擴增，對PCR產物進行回收與純化；回收得到的DNA與PMD18-T載體連接并轉化大腸桿菌；菌液PCR檢測，選取有單一目的條帶的送南京金斯瑞生物科技有限公司測序；?

5)將AFLP標記轉化為更穩定的SCAR標記：?

根據AFLP擴增特異序列的測序結果，利用Primer?Premier?5.0設計SCAR引物，進行PCR擴?增，反應體系20μl，其中10×PCR?buffer(Mg²⁺free)2μl，Mg²⁺1.2μl，dNTP(2.5mM)1.6μl，引物各1μl，雙鏈DNA?2μl，5U?rTaq?0.2μl，加ddH₂O至20μl；擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸80s，40個循環；72℃延伸5min，PCR產物于1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在UVP成像系統上自動成像，篩選出不結球白菜雄蕊瓣化品系W053及其保持系W052間的多態性片段，從而獲得不結球白菜雄性不育基因的1個300bp的SCAR標記片段，其標記引物為SCAR33。?