[發明專利]來源于荔枝的啟動子及其應用

有效

• 申請號: 201210533536.0
• 申請日: 2012-12-11
• 公開（公告）號: CN102994504A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 王家保;張新春;劉保華;孫進華;李煥苓
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N5/10;C12N1/21;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;王慧鳳

技術領域

本發明涉及生物領域中的一種啟動子及其應用，特別涉及一種來源于荔枝妃子笑品種的啟動子及其應用。

背景技術

荔枝果皮褐變一般設計兩方面：一是非酶促褐變，二是酶促褐變。酶促褐變是荔枝果皮褐變的主要原因。酶促褐變是指荔枝內的酚類物質被酚氧化酶類催化生成醌類物質；醌在植物體內能發生自身聚合或與細胞內的氨基酸和蛋白質發生反應產生黑色或褐色的物質，使荔枝果皮發生褐變。在荔枝果皮的酶促褐變中至少有3種酶參與了酚的氧化，即花色素苷酶（ANT）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）。果皮中含有多種酚類物質，多數可被PPO及POD氧化。相對POD而言，PPO對果皮酶促褐變的作用更大，是果皮酶促褐變的關鍵酶。果皮中的PPO活性分布范圍與酚類物質規律一致，在外果皮的表皮細胞、厚壁細胞、中果皮及內果皮的部分細胞都存在；PPO活性部位也隨褐變部位的擴散而擴散，與褐變過程一致。而果皮中的POD活性主要分布于中果皮與內果皮的維管束中，外果皮細胞較少。因此，抑制PPO活性是控制果皮褐變的關鍵技術。譚興杰等（1987）從荔枝果皮酚類物質中分離出PPO的天然底物，并將部分純化的荔枝果皮PPO蛋白與該底物作用，生成褐色物質，證實了荔枝果皮中的確有PPO的底物存在，進一步證明PPO酶促褐變是荔枝果皮褐變的內因之一。用SO2薰蒸和熱處理兩種方法對PPO活性和褐變的影響做了相關研究，發現PPO活性的高低與褐變程度的變化基本上一致。表明PPO是參與荔枝酶促褐變過程的重要酚氧化酶（蔣世云等，1999）。

基因表達受順式作用因子與反式作用元件共同調控，而啟動子則是基因表達的“開關”。深入研究荔枝PPO基因啟動子可為進一步研究PPO基因表達、酶活性變化及果皮褐變之間的關系提供基礎與依據，也可為通過基因工程技術培育荔枝新材料提供基礎，具有重要的理論與應用價值。

近年來，許多物種的PPO基因被克隆，如馬鈴薯、煙草、葡萄、番茄、蘋果、茶等物種。PPO由多個基因編碼，表現出多基因家族性。PPO基因表達比較復雜，其表達的種類及表達量都不同，由啟動子不同順式作用元件調控。PPO基因的5＇和3＇的非編碼區的保守性較低，差異性較大，尤其是5′啟動子區(Newman?SM?et?al.，2003)。番茄中7個PPO基因中5個啟動子不同，而馬鈴薯6個PPO基因的啟動子差異更大?？赡苷怯捎趩幼有蛄胁町愐餚PO基因時空表達模式差異。

酶促褐變是荔枝果皮褐變的主要因素，PPO是酶促褐變中主要的酚氧化酶，PPO酶活性受PPO基因表達調控，而PPO基因表達有啟動子調控。本研究在實驗室克隆獲得PPO基因編碼序列的基礎上，采用TAIL-PCR法和接頭PCR法，克隆獲得荔枝果皮PPO基因啟動子序列，確定了荔枝果皮PPO基因的啟動子的核心區域和組織特異性，對荔枝果皮PPO基因啟動子功能進行初步鑒定。PPO啟動子克隆主要是為研究PPO與果皮褐變關系，從轉錄水平控制PPO引起的酶促褐變提供基礎。

發明內容

本發明的目的是提供一種植物啟動子及其應用。該啟動子具有在荔枝的果皮和葉片中特異性表達，可以用于培育轉基因植物并控制外源基因的組織特異性表達，特別是在荔枝果皮中的組織特異性表達。

本發明所提供的啟動子，來源于無患子科荔枝（L.chinensis?Sonner）妃子笑品種，可以是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中序列1的DNA序列；

2）序列表中序列1自5′端第1-1048位的DNA序列；

3）序列表中序列1自5′端第82-1048位的DNA序列；

4）序列表中序列1自5′端第379-1048位的DNA序列；

5）序列表中序列1自5′端第622-1048位的DNA序列；

6）與1）、2）3）、4）或5）限定的DNA序列具有90%以上相似性，且具有啟動子功能的DNA序列；

7）在高嚴謹條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。

上述高嚴謹條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。

其中，序列表中序列1是由1073個脫氧核苷酸組成。

含有上述啟動子的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬于本發明的保護范圍。