[發(fā)明專利]一種高催化效率堿性淀粉酶突變體及其制備方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210533264.4
• 申請(qǐng)日: 2012-12-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102965360A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳堅(jiān);堵國(guó)成;劉龍;李江華;楊海泉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/28
• 分類號(hào): C12N9/28;C12N15/70;C12R1/07
• 代理公司: 北京愛(ài)普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高催化效率淀粉酶突變體及其制備方法。

背景技術(shù)

α-淀粉酶（EC3.2.1.1）是一種降解淀粉的重要的工業(yè)用酶，主要應(yīng)用在食品、紡織、醫(yī)藥、洗滌劑等領(lǐng)域。耐氧化性淀粉酶可用于紡織品退漿、洗滌劑添加劑以及以淀粉作粘結(jié)劑的粘度調(diào)節(jié)劑等。Horikoshi在1971年首先報(bào)道了產(chǎn)自嗜堿菌A-40-2的堿性淀粉酶。2007年Saxena等人篩選到一株可以產(chǎn)堿性淀粉酶的菌株。2010年P(guān)ancha等（Pancha?I,Jain?D,ShrivastavA,Mishra?S,Shethia?B,Mishra?S,VP?M,Jha?B.A?thermoactive[alpha]-amylase?from?a?Bacillus?sp.isolated?fromCSMCRI?salt?farm.International?Journal?of?Biological?Macromolecules,2010,47(2):288-291.）篩選出一株產(chǎn)耐溫淀粉酶菌株。目前，國(guó)內(nèi)的前處理酶制劑市場(chǎng)基本被丹麥諾維信公司和美國(guó)杰能科公司所壟斷。諾維信公司介紹了一種淀粉酶，有較寬的pH及溫度范圍。具有耐化學(xué)氧化性的淀粉酶主要應(yīng)用于洗滌劑添加劑和紡織退漿一浴法等工業(yè)中。但耐氧化性淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)并沒(méi)有報(bào)道。耐氧化性淀粉酶生產(chǎn)菌株的獲得主要通過(guò)篩選、誘變和酶分子改造獲得。篩選的盲目性較大，不容易獲得目的菌株。誘變包括：自然突變和誘變，自然突變的幾率相當(dāng)小，誘變的工作量較大且不可控出現(xiàn)負(fù)突變的幾率較大。酶分子改造目的性強(qiáng)，針對(duì)酶分子具體結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行改造，達(dá)到耐氧化性的目的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種高催化效率淀粉酶突變體，是淀粉酶的N端區(qū)域與短肽通過(guò)PT-linker連接得到的突變體。

所述短肽氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

所述淀粉酶氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

所述PT-linker序列如SEQ?ID?NO.3所示。

本發(fā)明還是提供一種制備所述淀粉酶突變的方法，其技術(shù)方案如下：

1）據(jù)短肽序列，采用化學(xué)全合成的方法全合成后克隆到質(zhì)粒pET-22b(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b(+)-P；

2）根據(jù)嗜堿芽孢桿菌（Bacillus?alcalophilus）的淀粉酶序列，采用化學(xué)全合成的方法全合成；

3）針對(duì)已分析序列設(shè)計(jì)引物，將全合成的淀粉酶序列克隆到重組質(zhì)粒pET-22b(+)-P中，構(gòu)建含有短肽和淀粉酶片段的重組質(zhì)粒pAAQ-P，將短肽融合到堿性淀粉酶的N-端，獲得含有突變淀粉酶序列與短肽序列融合狀態(tài)的重組載體；

4）將突變后重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，誘導(dǎo)表達(dá)，獲得突變株。

5）測(cè)定突變株表達(dá)淀粉酶的催化效率。

本發(fā)明提供的淀粉酶突變體催化效率高，在此改造條件下，嗜堿芽孢桿菌淀粉酶比酶活比對(duì)照（突變前）例的比酶活提高4.1倍；催化效率比對(duì)照（突變前）例的催化效率提高3.5倍。相對(duì)于采用篩菌或誘變等手段，縮短了酶學(xué)性質(zhì)改造時(shí)間。將該高催化效率淀粉酶突變體應(yīng)用于紡織退漿、洗滌劑添加等領(lǐng)域，可以在高效降解淀粉，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1：pAAQ-P的質(zhì)粒圖譜。

圖2：淀粉酶3D空間結(jié)構(gòu)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：淀粉酶高催化效率提高突變分析與方法

通過(guò)對(duì)淀粉酶3D空間結(jié)構(gòu)（圖2）進(jìn)行分析，確定區(qū)域A（催化區(qū)域）、區(qū)域B、區(qū)域C。同時(shí)，對(duì)催化區(qū)域（催化區(qū)域）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)活性位點(diǎn)（Asp238,Glu268,Asp330）。根據(jù)淀粉酶的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)相關(guān)性，選用短肽與堿性淀粉酶序列進(jìn)行融合表達(dá)，提高其催化效率。