[發明專利]甘精胰島素前體的酶切轉化方法

在審

• 申請號: 201210532873.8
• 申請日: 2012-12-11
• 公開（公告）號: CN102994600A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 趙志全;熊繼元;于鋒臣
• 申請（專利權）人: 魯南新時代生物技術有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種甘精胰島素前體的酶切轉化方法，特別涉及一種利用胰蛋白酶將甘精胰島素前體酶切使轉化成甘精胰島素的方法。

背景技術

甘精胰島素(glycine-arginine?insulin)是一種通過基因重組技術獲得并用于治療Ⅰ、Ⅱ型糖尿病的長效胰島素類生物制品，其持續控制血糖的原理為：皮下注射后甘精胰島素分子立即聚合，因而溶解度降低，形成甘精胰島素沉淀物，機體吸收延遲，其降糖作用的時間也被延長。重組甘精胰島素是當前治療Ⅰ、Ⅱ型糖尿病十分方便和有效的藥物。國外由Aventis公司生產的重組甘精胰島素商品名為來得時（Lantus），國內由甘李藥業有限公司生產的重組甘精胰島素注射液商品名為長秀霖。

甘精胰島素（glycine-arginine?insulin,簡稱Glargine）的設計結構為21^A-Gly-30^Ba-L-Arg-30^Bb-L-Arg-人胰島素，即將人胰島素A鏈的21位Asn替換成Gly，在B鏈的30位氨基酸后加入2個Arg而成。完整的重組甘精胰島素由A鏈和B鏈共53個氨基酸組成，其中A鏈含有21個氨基酸，B鏈含有32個氨基酸。甘精胰島素在大腸桿菌中以包涵體形式表達，表達產物為融合形式的重組甘精胰島素前體，前體的結構設計為在B鏈和A鏈之間加入C肽（由33個氨基酸組成），組成的融合甘精胰島素前體蛋白，線性序列為B（32）-C(33)-A(21)。該C肽保證了A鏈和B鏈的正確折疊，可通過胰蛋白酶酶切切除。

甘精胰島素前體蛋白的氨基酸序列中有4個精氨酸和2個賴氨酸（Arg²³，Arg?³¹，Arg?³²，Arg?⁶⁵；Lys²⁹，Lys?⁶⁴），都是胰蛋白酶的酶切位點。因此，采用胰蛋白酶將前體蛋白中的Arg?³²和Arg?⁶⁵羧基端切斷，即可去除C肽后得到甘精胰島素。然而，由于其他酶切位點的存在，胰蛋白酶作用于前體蛋白時不僅僅使Arg?³²和Arg?⁶⁵羧基端斷裂，而且還可能將Arg²³，Lys²⁹和Lys?⁶⁴位點切斷，從而產生酶切副產物，降低了酶切收率，給后續純化帶來困難。

中國專利CN?1052332中公開了制備脫（64，65）胰島素原的方法，即用胰蛋白酶處理人胰島素原，產生的物質中包括（65-A1裂開）HPI，用羧肽酶B處理提純的（65-A1裂開）HPI，可得到脫（64，65）胰島素原。然而，在已公開文獻中鮮有關于重組甘精胰島素酶切工藝及參數的報道。

發明內容

本發明的目的在于通過優化酶切工藝參數，提供一種甘精胰島素前體的酶切轉化方法，即用胰蛋白酶酶切甘精胰島素前體，使之轉化生成甘精胰島素的方法。該方法能最大程度地降低副產物的生成，給后續純化工作帶來了極大方便。

本發明的目的是通過采用下述技術方案來實現的：

一種甘精胰島素前體的酶切轉化方法，包括如下步驟：將甘精胰島素前體溶解于pH8～11的緩沖液中，控制反應體系的溫度為0～37℃，按胰蛋白酶與甘精胰島素前體的質量比為1：1000～10000加入胰蛋白酶，反應2～40小時；所述緩沖液選自碳酸氫銨、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸或磷酸鹽的緩沖液。

上述甘精胰島素前體的酶切轉化方法，其中所述緩沖液優選為20～100mM?碳酸氫銨，pH8～10；或20～100?mM?Tris-CL，pH9～11；或20～100mM?甘氨酸，pH9～11。

上述甘精胰島素前體的酶切轉化方法，優選將甘精胰島素前體按5～10?g/L的濃度溶解于所述緩沖液中。

所述胰蛋白酶為未經甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）處理或經甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮處理的來自豬或牛的胰蛋白酶。

進一步優選地，所述甘精胰島素前體的酶切轉化方法，其中用于甘精胰島素前體酶切轉化的反應溫度為4～25℃。

進一步優選地，所述甘精胰島素前體的酶切轉化方法，其中用于甘精胰島素前體酶切轉化的反應時間為5～30小時。