[發(fā)明專利]JAM1基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的方法及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210532533.5
• 申請(qǐng)日: 2012-12-11
• 公開（公告）號(hào): CN103031278A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉厚奇;仵敏娟;郭曉燦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/12;C12N15/867;A61K35/54;A61P17/14
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

1.一種鏈接粘附分子JAM1基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

A、設(shè)計(jì)并合成引物如下：

上游引物如SEQ?ID?NO:1所示，

下游引物如SEQ?ID?NO:2所示；

以人表皮細(xì)胞總RNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增，制備JAM1cDNA序列如SEQ?ID?NO:3所示；

B、構(gòu)建慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒pGC-FU-JAM1-GFP；

C、將慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒pGC-FU-JAM1-GFP顆粒感染人早胚來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得JAM1高表達(dá)的人早胚來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，即JAM1^ov-hMSC。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鏈接粘附分子JAM1基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟B具體為：

設(shè)計(jì)并合成引物如下：

JAM1-Age?I-F如SEQ?ID?NO:4所示，

JAM1-Age?I-R如SEQ?ID?NO:5所示，

Ubi-F如SEQ?ID?NO:6所示，

EGFP-N-R如序列SEQ?ID?NO:7所示；

采用PCR方法從JAM1真核表達(dá)載體中釣取目的基因；

使用Age?I對(duì)獲得的JAM1過表達(dá)質(zhì)粒和病毒載體進(jìn)行酶切以獲取線性化模板；

PCR產(chǎn)物交換進(jìn)入線性化慢病毒載體制備慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒pGC-FU-JAM1-GFP。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種鏈接粘附分子JAM1基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟C具體為：

先將10μL三個(gè)不同梯度的病毒加到各組的相應(yīng)孔中。加入的病毒量分別為5×10⁵TU，1×10⁵TU，1×10⁴TU，而細(xì)胞經(jīng)過生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞的數(shù)目大約為1×10⁴個(gè)，所以三個(gè)孔的MOI分別為50、10、1；

每孔中加入10μL的Polybrene稀釋液；

在水平方向輕輕拍打培養(yǎng)板，使培養(yǎng)基和病毒等試劑充分混勻，然后把細(xì)胞板放回培養(yǎng)箱孵育；

培養(yǎng)8~12h以后觀察細(xì)胞狀態(tài)，棄去細(xì)胞上清，更換為新鮮培養(yǎng)基；

感染3~4天后，觀察熒光表達(dá)情況。對(duì)于生長(zhǎng)緩慢代謝慢的細(xì)胞，可以適當(dāng)延長(zhǎng)觀察時(shí)間，中途可以換液，保持細(xì)胞的活性；

通過細(xì)胞感染效果，確認(rèn)MOI值為50可獲得最佳感染效果。

4.一種如權(quán)利要求1所述的鏈接粘附分子JAM1基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的方法獲得的JAM1^ov-hMSC。

5.一種如權(quán)利要求1所述的鏈接粘附分子JAM1基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的方法在制備促進(jìn)毛發(fā)再生的干細(xì)胞中的應(yīng)用。

6.一種如權(quán)利要求1所述的鏈接粘附分子JAM1基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的方法在細(xì)胞移植促進(jìn)局部皮膚毛發(fā)再生中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的鏈接粘附分子JAM1基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的方法在細(xì)胞移植促進(jìn)局部皮膚毛發(fā)再生中的應(yīng)用，是將10⁴JAM1^ov-hMSC皮內(nèi)移植到3周齡裸鼠皮膚組織，在裸鼠皮膚微環(huán)境的誘導(dǎo)下，JAM1^ov-hMSC遷移到裸鼠毛囊，使裸鼠毛囊生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，毛囊結(jié)構(gòu)改善，毛發(fā)再生。