[發明專利]一種禽腺病毒轉移載體及其制備方法

無效

• 申請號: 201210532531.6
• 申請日: 2012-12-11
• 公開（公告）號: CN103060376A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 周潔;趙莉;朱妍;高誠;胡建華
• 申請（專利權）人: 上海實驗動物研究中心;周潔
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/66;C12N15/65;C12N7/01;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 俞宗耀;林煒

技術領域：

本發明屬于基因工程領域,尤其涉及一種載體，具體來說是一種禽腺病毒轉移載體及其制備方法。

背景技術：

腺病毒是目前動物病毒中在形態和化學結構上發明得最為詳細的病毒之一，其主要原因是腺病毒沒有囊膜，衣殼結構清晰，易在電子顯微鏡下仔細觀察，核酸和蛋白質易分離。而且近年來，部分血清型的腺病毒基因組結構、復制、轉錄特征已發明得相當清楚，特別是一些腺病毒載體在臨床上的成功應用，使得以重組腺病毒為載體參與基因治療與基因免疫受到普遍重視。

腺病毒作為基因轉移載體被廣泛應用于基因治療及重組疫苗發明等領域，但多方面因素阻礙了人腺病毒（hAd）載體作為人和動物基因治療載體和重組活疫苗的應用，包括人體內預存中和抗體、復制缺陷型和野生型人腺病毒間互補/重組循環污染載體、多種血清型人腺病毒可在動物細胞中復制等。開發動物腺病毒載體可能會解決上述問題。某些動物腺病毒具有轉導人源細胞中的能力，并且動物腺病毒由于具有高度種屬特異性，雖能進入人體細胞卻不能在其中復制繁殖，缺乏與人腺病毒的同源性不會發生共復制和重組，人體內也不存在預先針對它們的免疫應答。因此，應用非人腺病毒載體，結合免疫抑制策略可能成為基因治療可供選擇的途徑。對動物而言，以其自身種屬的腺病毒載體作為獸用重組疫苗會比用hAd載體更為有效。因此，開發動物腺病毒載體用于基因轉移，將具有廣闊的應用前景。目前發明得較多的動物腺病毒有牛、豬、犬、鼠、禽類等。近幾年來，利用禽腺病毒做載體已成為禽病疫苗發明的熱點。禽腺病毒屬主要包括過去根據群特異性抗原差異分類的I群禽腺病毒，包括傳統禽腺病毒及分離自雞、火雞、鵝和其它禽類的腺病毒，共12個血清型，享有一種共同的群抗原。由于I群禽腺病毒多數呈隱性感染，不引起明顯臨床癥狀，被認為是活病毒載體的候選株。

禽腺病毒載體與其他病毒載體比較，具有許多獨特的優點：⑴致病性低，安全性好,在機體內復制不整合到宿主細胞染色體中，無插入致突變性,未發現其與人類腫瘤的發生有直接關系。⑵靶細胞種類較為廣泛，并且能感染繁殖期、靜止期和高度分化的細胞和高水平表達外源基因，并且在受體細胞中能高效復制。⑶腺病毒粒子相對穩定，就目前常用載體的血清型而言，病毒基因組重排頻率低，外源基因片段插入片段在病毒連續復制幾個周期后一般仍保持不變，腺病毒基因組相對易于進行重組DNA技術操作。⑷可以在腸道及呼吸道繁殖，可制成藥囊經口服途徑接種，應用方便。⑸能在雞胚或細胞中有效增殖，病毒滴度高。⑹禽腺病毒基因組較大，插入大片段外源性基因的潛力大。

在較早的發明中，對CELOV基因組的限制性片段圖譜和病毒結構蛋白已有詳細報告。Susanna?Chiocca等完成了I型禽腺病毒代表種雞胚致死孤兒病毒CELOV的基因組全序列測定工作。編碼主要的病毒結構蛋白的基因（Ⅲa、pentonbase、hexon、pⅥ和pⅧ）以及編碼52k、100k蛋白的基因、E2區基因、Ⅳa2基因，均在基因組預期位置出現。

Anne-isabelle?Michou等對禽腺病毒CELOV基因組進行突變發明，結果鑒定了一系列可被缺失但需通過反式提供調節因子修復復制的病毒復制必需區和一個復制非必需區。此外，該發明還證實CELO載體可以與Ad5一樣有效轉導多種哺乳動物細胞，有望替代基于Ad5載體用于哺乳動物轉基因發明。同時由于禽腺病毒與牛、羊、犬等其他動物腺病毒一樣，對人源細胞天然存在復制缺陷，即使在人腺病毒存在的情況下，也不能在人源細胞內大量復制存在，因此有較高的生物安全性。

DY?Logunov等探討了利用禽腺病毒CELOV載體作為轉基因工具的可能性。他們構建了一系列重組CELO病毒并證實即使在體內已有針對Ad5的免疫反應的情況下它們也能很好的將基因轉入各種器官內。產生的CELO-p53載體修復了p53抑制腫瘤活性的功能，它們既能在體外人的腫瘤細胞中也能在移植裸鼠體內的異種移植物中發揮抗腫瘤活性，在裸鼠身上甚至伴隨抑制腫瘤生長的作用。

非人源腺病毒載體在基因治療方面具有較好的免疫學特性，但常常不能有效轉導人源細胞。Stevenson等探索了用非基因性的聚合體包裝CELOV，并用堿性成纖維生長因子（bFGF-pc-CELOluc）重建靶向，實現了有效的靶向性改造。Claire?Barra等為開發輔助病毒依賴型CELOV載體用作禽源疫苗，初步鑒定了CELOV的順式作用元件。結果表明基因組左末端nt200-250和nt250-300的區域對病毒包裝分別起著很重要和必需的作用。