[發(fā)明專利]一種黑曲霉菌株生產(chǎn)的脂肪酶及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210532006.4
• 申請日: 2012-12-10
• 公開（公告）號: CN103060286A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡松青;劉光;李琳;侯軼;王昕哲
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12P7/62;C12R1/685
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，具體涉及利用來源于西藏傳統(tǒng)食品中的黑曲霉所產(chǎn)生的胞外脂肪酶，以及脂肪酶的生產(chǎn)方法和應(yīng)用。?

背景技術(shù)

脂肪酶（EC3.1.1.3），即三酰基甘油酰基水解酶，能將甘油三酯催化水解為游離脂肪酸和二酰甘油、一酰甘油或甘油。此外，還可以催化一系列反應(yīng)如酯化反應(yīng)、酯交換反應(yīng)、酸解、醇解、氨解等反應(yīng)（徐玉麗等，微生物學(xué)報，2011，51(2)：233-240）。脂肪酶廣泛存在于動物、植物、微生物中（王自社等，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(7)：3798-3800），而微生物脂肪酶比動、植物脂肪酶具備更好的穩(wěn)定性、更強的耐有機溶劑性、更廣的底物特異性（劉海洲等，食品研究與開發(fā)，2009，30(1)：141-143），胞外脂肪酶被證實為具有高產(chǎn)、高效和高選擇的生物催化劑，在制藥、食品、化妝品和洗滌劑等工業(yè)得到廣泛應(yīng)用（Pandey?A，Appl.Biochem.，1999，29：119-131）。?

隨著人們對微生物脂肪酶認(rèn)識的不斷加深，應(yīng)用范圍正在不斷拓寬，對酶的耐受性（極端溫度、壓力）要求也越來越高，許多工業(yè)用脂肪酶不能夠滿足苛刻的工藝溫度、pH和有機溶劑而限制了其使用（董明奇等，四川大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，45（4）：985-990）。因此，發(fā)掘具有特殊酶學(xué)性質(zhì)的產(chǎn)脂肪酶菌株具有很大的工業(yè)應(yīng)用價值，而這些菌株一般都來源于特殊的生長環(huán)境。?

關(guān)于黑曲霉產(chǎn)脂肪酶，國內(nèi)只有零星的菌種選育（任麗虹等，工業(yè)微生物，26（1）：23~26，1996）和脂肪酶的分離純化（舒正玉等，生物工程學(xué)報，23（1）：96~100，2007）報道，而且目前的脂肪酶大部分為堿性或中性脂肪酶，限制了工業(yè)應(yīng)用。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種黑曲霉菌株產(chǎn)生的脂肪酶及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用，利用來源于西藏傳統(tǒng)食品中的黑曲霉，通過發(fā)酵培養(yǎng)制備粗酶液，進一步通過鹽析、透析和層析分離制備電泳純脂肪酶。?

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：?

本發(fā)明從西藏奶渣中分離出一株脂肪酶產(chǎn)生菌，編號為0512。根據(jù)菌株的形態(tài)特征和18S?rRNA分子鑒定，確定0512菌株為黑曲霉（Aspergillus?niger），并進一步將該菌株編號為AN0512。本發(fā)明菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）。地址：北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101，保藏日期是2012年11月19日，保藏號是CGMCC?No.6835。?

一種利用上述黑曲霉菌株生產(chǎn)脂肪酶的方法，包括如下步驟：?

將處于對數(shù)生長期的黑曲霉（Aspergillus?niger）AN0512菌懸液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為1.4%-1.6%v/v，進行發(fā)酵培養(yǎng)，將得到的發(fā)酵液離心或過濾去除菌體即得粗酶液；液體發(fā)酵培養(yǎng)基主要包括w/w：橄欖油0.8%-1.2%，酵母提取物0.5%-2%，pH?5.0-7.0，以及磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.05%、氯化鉀0.05%，余量為水。?

優(yōu)選地，所述粗酶液還經(jīng)如下分離純化步驟：粗酶液經(jīng)百分飽和濃度為?50-70%w/v的硫酸銨沉淀，離心取沉淀，用磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，離心去沉淀，將清液透析除鹽后，采用陰離子層析、分子排阻層析分離，獲得電泳純脂肪酶。?

優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為：攪拌轉(zhuǎn)速150-250r/m，培養(yǎng)溫度27-29℃，發(fā)酵時間90-100h。?

上述所得粗酶液用于催化酯交換或酯化反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25-60℃，pH為4.0-10.0。優(yōu)選地，所述粗酶液催化反應(yīng)的溫度為27-35℃，pH為6.0-8.0。?

上述所得電泳純脂肪酶用于催化酯交換或酯化反應(yīng)的溫度為20-60℃，反應(yīng)的pH為3.0-8.0。優(yōu)選地，所述脂肪酶催化反應(yīng)的溫度為45-55℃，pH為4.0-6.0。進一步優(yōu)選地，所述脂肪酶的催化反應(yīng)溫度為50℃，pH為5.0。?

在所述酯交換或酯化反應(yīng)中添加Cu²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮或丁醇以促進脂肪酶的催化反應(yīng)。而加入Fe²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、EDTA、洗滌劑則可以抑制所述脂肪酶的催化反應(yīng)。?

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：?