[發明專利]酸性脲酶的生產方法

有效

• 申請號: 201210531870.2
• 申請日: 2012-12-11
• 公開（公告）號: CN102994487A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 唐清蘭;徐姿靜;魏勇;徐占成;劉孟華;樊科權;焦小川
• 申請（專利權）人: 四川綿竹劍南春酒廠有限公司
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12R1/66
• 代理公司: 成都虹橋專利事務所(普通合伙) 51124
• 代理人: 梁鑫

技術領域

本發明涉及酸性脲酶的生產方法，屬于酶制劑技術領域。?

背景技術

脲酶（Urease，urea?amidohydrolase，EC?3．5．），又稱尿素氨基水解酶，存在于大多數細菌、曲霉和高等植物里。它是一種酰胺酶、能使有機物質分子中酶鍵水解。其作用極為專性的，它僅能水解尿素，水解的最終產物是氨和碳酸。有部分微生物產生的酸性脲酶(acid?urease)不同于植物中提取的中性、偏堿性脲酶，酸性脲酶能耐受酸性環境，在pH4.0～5.5的體系中仍具有活性^[1]。?

在國外，乳酸桿菌已經被用于生產脲酶酶制劑，有效地減少葡萄酒中尿素含量^[2-6]。在國內，脲酶已經被用于降低黃酒中尿素含量。但是，酒用脲酶在我國尚未形成生產能力，目前所用的酶制劑均從國外進口^[7]。例如，浙江古越龍山紹興酒股份有限公司購買日本生產的酒用酸性脲酶去除黃酒中的尿素，該酸性脲酶在紹興黃酒中作用時間48h左右，可有效除去黃酒中約80%的尿素^[8]。?

隨著國內對酸性酒用脲酶的需求量不斷增加，迫切需要解決酒用脲酶在國內生產能力不足的現狀，因此酒用脲酶的研究對我國釀酒業的發展，拓展國際市場等方面均有深遠的意義。目前，江南大學分離獲得腸出血性大腸埃希氏菌，利用該菌株生產出純度較高的酒用脲酶制劑，然后將酶制劑添加到黃酒中，24h后尿素去除率為70％以上^[9]。?

由于酒用酸性脲酶被作為食品添加劑直接添加到葡萄酒或者黃酒中，而目前報道的產脲酶菌株都是細菌，普遍從動物糞便（鳥糞、鼠糞、牛羊糞便），農田土壤，污泥等中分離獲得?^[9]，并且需要一系列復雜的酶純化提取工藝才能獲得高純度的酶制劑，從而極大的增加了生產成本，也增加了大規模生產的難度。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供酸性脲酶的生產方法。?

本發明的技術方案是酸性脲酶的生產方法，包括如下步驟：利用聚多曲霉Aspergillus?sydowii?JNC-U5?CGMCC?No.6577發酵，提取，得到脲酶制劑。?

進一步的，所述的發酵是指將聚多曲霉接種到麥芽汁培養基中，于30~35℃、150~250rpm、溶氧（PO₂）100%條件下發酵5~7天；其中，聚多曲霉的孢懸液濃度為10⁵~10⁶個/mL，孢懸液的體積占麥芽汁培養基體積的1~2‰。?

所述的PO₂是發酵罐好氧培養時候的一個參數，即發酵罐在運行時，溫度、攪拌速度、pH的實際值達到穩定狀態，且通入空氣使溶氧值不再變化時，將溶氧值校準為100%。校準?好后在進行接種。?

優選的，于35℃，150rpm，培養時間為7天。?

進一步的，所述的麥芽汁培養基的制備方法如下：取大麥芽粉碎，加3~5倍（優選4倍）于麥芽質量的55~60℃的水，在55~60℃下保溫3~4h，過濾，煮沸，過濾，將麥芽汁濃度調整到5～7波美（⁰BX）（波美是糖度的單位，本發明中可用蒸餾水調糖度），115℃下滅菌20分鐘備用。?

進一步的，所述的提取指在發酵完畢后收集菌絲，干燥菌絲，粉碎菌絲。?

優選的，收集菌絲時用無菌水洗滌菌絲。?

優選的，粉碎菌絲過80目篩，收集菌絲粉末即得到酶制劑。?

本發明還提供了所述酸性脲酶的生產方法在生產酸性脲酶中的用途。?

本發明方法利用高產脲酶的聚多曲霉生產酸性脲酶。該菌株產脲酶活性可達到49.7U。本發明根據聚多曲霉的特性，對發酵條件以及提取工藝進行了研究優化，使得本發明的生產方法工藝簡單、投入少，可規模化大生產。本發明方法為酸性脲酶的生產提供了新的選擇。?

本發明的聚多曲霉（Aspergillus?sydowii）JNC-U5于2012年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏號為CGMCC?No.6577，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101。?

附圖說明

圖1pH對脲酶活性的影響?

圖2尿素去除率測定?

具體實施方式