[發(fā)明專利]一種測(cè)定低聚鳳梨參糖胺聚糖含量的分析方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210530128.X
• 申請(qǐng)日: 2012-12-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103869002A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 嚴(yán)啟新;于琳;梁慧;曾偉珍;康暉;王兵;馮漢林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳海王藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 北京律誠(chéng)同業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種測(cè)定低聚鳳梨參糖胺聚糖含量的分析方法。本發(fā)明是基于申請(qǐng)人于2009年11月6日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?00910110114.0、名稱為“低聚巖藻糖化糖胺聚糖及其制備方法”以及2009年11月25日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?00910109861.2、名稱為“低聚鳳梨參糖胺聚糖及其制備方法”的發(fā)明專利的進(jìn)一步發(fā)明，所述專利申請(qǐng)的全文以參考文獻(xiàn)的形式結(jié)合于本發(fā)明說(shuō)明書。

背景技術(shù)

低聚鳳梨參糖胺聚糖，是指一類從棘皮動(dòng)物體壁或內(nèi)臟中提取獲得的，具有類似于硫酸軟骨素主鏈結(jié)構(gòu)，但具有側(cè)鏈硫酸巖藻糖取代的糖胺聚糖衍生物(J?Biol?Chem，1988，263(34)：18176-83和J?Biol?Chem，1991，266(21)：13530-6)。巖藻糖化糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)特征為，含有摩爾比范圍為0.7～1.3的葡萄糖醛酸基和乙酰氨基半乳糖基或其硫酸酯，并且含有巖藻糖或其硫酸酯基，巖藻糖硫酸酯基與乙酰氨基半乳糖硫酸酯的摩爾比范圍為0.5～2.5；低聚巖藻糖化糖胺聚糖是指重均分子量為6000～20000Da范圍內(nèi)的巖藻糖化糖胺聚糖。低聚鳳梨參糖胺聚糖(dTHG)是鳳梨參(Thelenota?ananas)來(lái)源的巖藻糖化糖胺聚糖(THG)的解聚產(chǎn)物，其具有如下式所示的結(jié)構(gòu)：

式(I)中：-OR為羥基(-OH)、硫酸酯基(-OSO₃^-)、或?yàn)槿缡?II)所示的硫酸酯化巖藻糖基：

式(II)中：-OR定義同式(I)。

其中：?jiǎn)翁墙M成包括N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、巖藻糖(Fuc)、或其硫酸酯(以-OSO₃^-表示)，以摩爾比計(jì)，GalNAc∶GlcUA∶Fuc∶-OSO₃^-的比例約為1∶(1±0.3)∶(1±0.3)∶(3.5±0.5)，dTHG的重均分子量(Mw)為約8000～20000Da。優(yōu)選的分子量范圍為10000～18000Da，更優(yōu)選為12000～16000Da。

本申請(qǐng)人上述兩項(xiàng)發(fā)明專利分別闡述了低聚巖藻糖化糖胺聚糖和低聚鳳梨參糖胺聚糖制備工藝及活性，但未對(duì)其含量測(cè)定進(jìn)行報(bào)道。糖胺聚糖一方面不具備糖的紫外吸收特征，同時(shí)又有幾個(gè)糖的片段，而對(duì)于此類糖的純化分析研究，常規(guī)分析方法很難解決實(shí)際問(wèn)題。糖胺聚糖含量測(cè)定方法的復(fù)雜性及難度具體體現(xiàn)在糖胺聚糖結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜；其中糖胺聚糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指糖基的組成、糖基排列順序、相鄰糖基的連接方式、異頭碳構(gòu)型以及糖鏈有無(wú)分支、分支的位置與長(zhǎng)短等，大多數(shù)糖胺聚糖是由一個(gè)氨基己糖和一個(gè)己糖醛酸組成的二糖單元依據(jù)有規(guī)則的排列形成的直鏈多糖，然而其二糖單元也呈不均一性；糖胺聚糖的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多糖骨架鏈間以氫鍵結(jié)合的各種聚合體；糖胺聚糖鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)的重復(fù)順序由于糖單位的羥基、羧基、氨基以及硫酸基之間的非共價(jià)相互作用，導(dǎo)致有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)空間有規(guī)則而粗大的構(gòu)象，即是糖胺聚糖鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)；糖胺聚糖的四級(jí)結(jié)構(gòu)是指多聚鏈間非共價(jià)鍵結(jié)合形成的聚集體。

糖胺聚糖的常用分析方法是比色法為測(cè)定，但該方法操作步驟繁瑣，操作復(fù)雜，產(chǎn)物的比色度會(huì)不穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)性差，要求的靈敏度較高。且所測(cè)定的經(jīng)常是代表某一基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，對(duì)于代表總體多糖的含量，準(zhǔn)確性不一定高。其中，以分子中某一基團(tuán)的含量來(lái)定量糖胺聚糖的方法有：測(cè)定己糖醛酸的Carbazole法和測(cè)定己糖胺的Elson-Mor-gan法；這兩種方法都要用強(qiáng)腐蝕性酸，且反應(yīng)需在高溫下進(jìn)行[劉義錢，糖胺聚糖的分析測(cè)定方法，水產(chǎn)科學(xué)，2005，4(5)：46-49)]。

組織化學(xué)方法是測(cè)定糖胺聚糖最原始的方法。Karls-son曾利用糖胺聚糖和阿爾辛藍(lán)結(jié)合與分解的性能檢測(cè)糖胺聚糖含量。后來(lái)，有利用阿爾辛藍(lán)(Alcianblue)、1，9-二甲基亞甲藍(lán)(1，9-dimethylmethylene?blue)和天青A(azure?A)等染色劑直接比色法定性、定量分析糖胺聚糖。阿爾辛藍(lán)比色法靈敏度不及后兩者，且在高鹽溶液中結(jié)果不夠準(zhǔn)確，僅僅可以應(yīng)用于提取分離的初步篩選過(guò)程中。經(jīng)過(guò)改進(jìn)后的二甲基亞甲藍(lán)比色法不僅靈敏度高，而穩(wěn)定性和測(cè)量范圍都得到了提高。天青A比色法靈敏度很高，但是反應(yīng)條件要求高。[王長(zhǎng)云，管華詩(shī)，李八方.糖胺聚糖研究概況與展望.生物程進(jìn)展，1995，15(6)：2-10；劉義錢，糖胺聚糖的分析測(cè)定方法，水產(chǎn)科學(xué)，2005忙4(5)：46-49]